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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 网络生活区 » 有奖问答 » 实验讨论 » 求助毕赤酵母电转化问题
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guangxidaxue

金虫 (小有名气)

[求助] 求助毕赤酵母电转化问题

酵母是GS115，载体pPIC9K，构建成功后有11KB。SacI线性化。
电转化步骤：调但菌落培养过夜，然后转接100ML YPD培养基中，OD600约1.1~1.5时收集细胞，4度离心，冰水洗二次，1M山梨醇洗一次，最后用1ML山梨醇溶，取80UL与5-10ugDNA混溶，转入0.2cm预冷电转杯中，冰浴5min！1.5kv，25μF，200Ω条件下进行电转，立即加1ML 1M山梨醇，然后涂MD板！
在以上的条件下做了好几次了都没有长，求各位高手大侠帮帮忙！指点下。。。万分感谢！
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1楼 2011-05-10 20:47:04
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guangxidaxue

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by summit_power at 2011-06-15 15:27:30:
不要总局限于电转，可以试一下化转还有可以制作酵母感受态，制作好酵母感受态如果不好转可以一星期持续转，看人品，总能转进去！我正遇到你的问题，还有就是你的pPIC9k多大，线性化的话本来转化效率不高的！

不好意思这几天都没有登录，pPIC9k大概9.3KB。构建好的载体有11KB。你也是做毕赤酵母的基因组整合？
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3楼2011-06-20 10:05:24
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summit_power

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
guangxidaxue(金币+20): 5 2011-06-20 10:05:52
davin(金币+1): 鼓励新虫 2011-06-20 16:53:34
不要总局限于电转，可以试一下化转还有可以制作酵母感受态，制作好酵母感受态如果不好转可以一星期持续转，看人品，总能转进去！我正遇到你的问题，还有就是你的pPIC9k多大，线性化的话本来转化效率不高的！
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2楼2011-06-15 15:27:30
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summit_power

新虫 (初入文坛)
11kb不小，还是要坚持，试过之后再总结，化转可以试试，就是LiAc转化，按说毕赤酵母还好转的。。。我做的假丝酵母不好转
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4楼2011-06-21 22:26:10
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summit_power

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by summit_power at 2011-06-21 22:26:10:
11kb不小，还是要坚持，试过之后再总结，化转可以试试，就是LiAc转化，按说毕赤酵母还好转的。。。我做的假丝酵母不好转

还有就是山梨醇洗三次试试，再用山梨醇重悬
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5楼2011-06-21 22:29:07
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