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chengcheng8901

新虫 (初入文坛)

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专业: 病原细菌与放线菌生物学

[交流] 关于细菌RT-PCR的一些问题，希望同行探讨一下已有1人参与

最近在做白叶枯病原菌目的基因的RT-PCR，有些难题希望和各位探讨！我用的是天根的试剂盒提取的菌液的总RNA，效果还好，点两微升胶图很清晰，有明亮的三条带，虽然最小的那一条有些模糊。
但是提取的总RNA可能会有DNA污染，因此并需检测和纯化。以后面临了很多问题。
1、我采用什么方法去检测有没有DNA污染？（因为当时考虑的原核生物里没有内含子，因为我想采取用目的基因的引物去扩我提取的总RNA，我认为的是如何能扩出来目的片段则有DNA污染，因为我用的酶是普通的taq酶。不知道这种方法是否合适？）
2、有没有纯化效率高的方法？（我采用的是DNase I 消化，然后再抽提的方法，这里我有个问题是我能不能省去抽提的步骤，直接消化完后进行检测，再反转录）
3、由于在选择actin的时候考虑的真核和原核生物的看家基因不同，所以只能选择16srRNA作为control。
4、选择引物的时候？（一般真核生物都是选择oligdT，但是原核生物怎么办？用随机引物吗？）

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1楼 2011-05-04 14:01:31

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phyllislhy

木虫 (正式写手)

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性别: MM
专业: 微生物资源与分类学

★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖

1、用你经DNA酶处理的RNA为模板，16S rDNA保守区引物（扩出来一般是210多bp）扩增，引物google就能查到，25个循环，以DNA为对照，检测是否有DNA污染
2、不知道有没有试剂盒，你可以查一下，不过应该很贵
3、你可以查一篇文献，2008年的，作者里有Toth，是做Pectobacterium的关于持家基因的选择，可以参考一下
4、随机引物，6N或9N

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