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求助连接反应中的问题，谢谢!
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大家好，连接反应中遇到了问题，希望大家给予帮助，谢谢！ 最近一直在构建重组质粒载体，载体为PET28a，目的片段大约为500bp。因为我是在重复师长的实验，师长使用的连接条件是：NEB连接酶，22度，10min。因为我们没有定NEB连接酶，因此在开始时，我使用的连接条件是Takara T4连接酶，22度，10min。后来发现连不上，便将条件调节为16度，3个小时。可是转化涂板后发现依然没有单克隆生长。凝胶显示酶切也正常，回收片段的浓度也测定了，根据载体与目的片段1:10进行连接，可是，就是长不出单克隆。 另外，想请问：加连接体系时时需要是冰浴条件下吗？是否是在里阿杰反应中有一些该注意的细节没有注意呢？ 我实在是找不出自己是哪里出现问题了，希望大家给予帮助。谢谢了！ |
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qiujinfeng
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7楼2011-04-24 23:18:59
天使托
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2楼2011-04-23 22:52:01
xiaoweiwei121
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西瓜(金币+2): 鼓励应助 2011-04-23 23:30:27
wzc4884(金币+3): 2011-04-24 14:35:36
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wzc4884(金币+3): 2011-04-24 14:35:36
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当没有问题的时候，怎么做都行， 一旦有问题了，就郁闷了 建议你做实验的时候，把对照做全了，然后才好分析哪一步出了问题 具体请参看，http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=3105782&authorid=426591 |
3楼2011-04-23 23:18:41
sfb1020
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4楼2011-04-24 09:47:10
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