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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助连接反应中的问题，谢谢!
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wzc4884

金虫 (正式写手)

[求助] 求助连接反应中的问题，谢谢!

大家好，连接反应中遇到了问题，希望大家给予帮助，谢谢！
    最近一直在构建重组质粒载体，载体为PET28a，目的片段大约为500bp。因为我是在重复师长的实验，师长使用的连接条件是：NEB连接酶，22度，10min。因为我们没有定NEB连接酶，因此在开始时，我使用的连接条件是Takara T4连接酶，22度，10min。后来发现连不上，便将条件调节为16度，3个小时。可是转化涂板后发现依然没有单克隆生长。凝胶显示酶切也正常，回收片段的浓度也测定了，根据载体与目的片段1:10进行连接，可是，就是长不出单克隆。
    另外，想请问：加连接体系时时需要是冰浴条件下吗？是否是在里阿杰反应中有一些该注意的细节没有注意呢？
    我实在是找不出自己是哪里出现问题了，希望大家给予帮助。谢谢了！
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1楼2011-04-23 22:11:13
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qiujinfeng

木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

以前做过现在都忘记了哈哈
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努力不一定有结果，但不努力一定没有结果，相信自己才会有更好的明天
7楼2011-04-24 23:18:59
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

坛子里相似的问题很多。。。你可以搜搜相关的帖子，看看有没有和你问题一样的。。。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
2楼2011-04-23 22:52:01
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xiaoweiwei121

荣誉版主 (文坛精英)

这潭水蓝的深邃

优秀区长优秀区长优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励应助 2011-04-23 23:30:27
wzc4884(金币+3): 2011-04-24 14:35:36
当没有问题的时候，怎么做都行，
一旦有问题了，就郁闷了
建议你做实验的时候，把对照做全了，然后才好分析哪一步出了问题
具体请参看，http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=3105782&authorid=426591
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3楼2011-04-23 23:18:41
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sfb1020

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): 鼓励应助 2011-04-24 09:53:46
wzc4884(金币+2): 2011-04-24 14:35:28
我用宝生物的T4连接酶，16度连接过夜没有问题。肯定能连上
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2011-04-24 09:47:10
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