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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 怎P不出来呢？求解！
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li1977li

金虫 (小有名气)

[求助] 怎P不出来呢？求解！

准备克隆表达一蛋白，从烟曲霉中提RNA反转录后先做梯度PCR（10ul-10管）得出最佳退火温度为60度，接下来想做胶回收却怎么也P不出来目的基因了（1.3kbp),用的是相同的试剂、条件，50ul,100ul体系，50ul分成5管，100ul分成10管最后混合跑电泳都失败，纠结啊盼请高手分析原因，谢谢！附梯度条件：94° 1min,94° 5s,60-70°90s,72° 90s,35cycles,72° 10min.用的是Taq酶PCR Green Mix。
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1楼 2011-04-20 15:43:08
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yuxia82012

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

Taq的退火时间不用那么长吧，我们都用30s，还有解链时间是不是短了点？第一步一般都是3min，后面循环时用的1min吧
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在等待中涅槃重生
2楼2011-04-20 16:23:34
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li1977li

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yuxia82012 at 2011-04-20 16:23:34:
Taq的退火时间不用那么长吧，我们都用30s，还有解链时间是不是短了点？第一步一般都是3min，后面循环时用的1min吧

那为什么梯度做出而想大量扩增却没有呢？求解惑，谢谢！
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3楼2011-04-20 16:47:50
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yuxia82012

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励 2011-04-20 18:41:39
你是梯度做完后确定在60度最好是吧？后边扩增的话全用的60度，我有几个问题，就是你扩增产物说的跑电泳失败是只有引物二聚体条带吗？还是条带很弥散，在预期大小的地方有条带或者没有条带呢？如果只有引物二聚体的话，建议把温度降低点再扩增，还是没有的话很可能是模板不行了，得重新反转录做模板
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在等待中涅槃重生
4楼2011-04-20 16:59:36
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li1977li

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yuxia82012 at 2011-04-20 16:59:36:
你是梯度做完后确定在60度最好是吧？后边扩增的话全用的60度，我有几个问题，就是你扩增产物说的跑电泳失败是只有引物二聚体条带吗？还是条带很弥散，在预期大小的地方有条带或者没有条带呢？如果只有引物二聚体的 ...

后面扩增全是60度，电泳在100bp左右有很亮带应该是二聚体吧？而预期条带没有，请问降多少温度适宜啊?
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5楼2011-04-20 17:10:05
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yuxia82012

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

你直接降个5度试试，如果还是没有条带的话，十有八九是模板坏了，重新做模板吧
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6楼2011-04-20 17:41:05
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li1977li

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yuxia82012 at 2011-04-20 17:41:05:
你直接降个5度试试，如果还是没有条带的话，十有八九是模板坏了，重新做模板吧

谢谢！再做一次试试。另可以用保存在-70中提的RNA（存了一周,开始浓度为4000ug/ml）进行 RT吗？
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7楼2011-04-20 19:26:03
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yuxia82012

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

li1977li(金币+10): 2011-04-20 19:41:02
RNA最后别存太久，我们一般提出来后确定浓度后就直接反转录成CDNA存放，我不知道你那个降解程度如何，你反转录前还是跑个胶试试吧
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在等待中涅槃重生
8楼2011-04-20 19:30:54
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roomofxw

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
amisking(金币+1, EPI+1): 鼓励发帖应助。 2011-04-20 20:43:37
1.请验证模板是否OK
2.能否重复梯度PCR结果，包括PCR孔也要验证哦
3.是否是一管酶快用完了，剩下的活性不好了，或者不是同一批次的，可以做阳性对照
4.60-70度的梯度，确定是60度最佳，不科学啊，怎知降五度就不好呢？
5.应该保留梯度PCR产物，可以作为模板二次PCR；或者做阳性对照
重点检查模板，以及降低退火温度，不建议tag，保真性不好
说不定你梯度的那个孔在最边缘，设的六十度，实际只有58度……
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9楼2011-04-20 19:43:53
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roomofxw

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
li1977li(金币+10): very good! 2011-04-20 20:02:24
amisking(金币+2): 鼓励发帖应助。 2011-04-20 20:43:49
O(∩_∩)O哈！
不知道大家的实验材料保存多久？

我记得我一次从基因组里面钓基因出来，PCR出来了，送产物直接去测序了。
结果后面再做好几次，都没有出来
一怒让测序公司把那管子送回来，加了点水涮涮，取出来当模板，哈哈，OK

所以以后每次PCR产物，都尽量保存的。

当然酶最好用保真性好的，不然二次PCR就增加了突变的可能
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10楼2011-04-20 19:53:17
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