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li1977li

金虫 (小有名气)

[求助] 怎P不出来呢?求解!

准备克隆表达一蛋白,从烟曲霉中提RNA反转录后先做梯度PCR(10ul-10管)得出最佳退火温度为60度,接下来想做胶回收却怎么也P不出来目的基因了(1.3kbp),用的是相同的试剂、条件,50ul,100ul体系,50ul分成5管,100ul分成10管最后混合跑电泳都失败,纠结啊盼请高手分析原因,谢谢!附梯度条件:94° 1min,94° 5s,60-70°90s,72° 90s,35cycles,72° 10min.用的是Taq酶PCR Green Mix。
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yuxia82012

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

li1977li(金币+10): 2011-04-20 19:41:02
RNA最后别存太久,我们一般提出来后确定浓度后就直接反转录成CDNA存放,我不知道你那个降解程度如何,你反转录前还是跑个胶试试吧
在等待中涅槃重生
8楼2011-04-20 19:30:54
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yuxia82012

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

Taq的退火时间不用那么长吧,我们都用30s,还有解链时间是不是短了点?第一步一般都是3min,后面循环时用的1min吧
在等待中涅槃重生
2楼2011-04-20 16:23:34
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li1977li

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by yuxia82012 at 2011-04-20 16:23:34:
Taq的退火时间不用那么长吧,我们都用30s,还有解链时间是不是短了点?第一步一般都是3min,后面循环时用的1min吧

那为什么梯度做出而想大量扩增却没有呢?求解惑,谢谢!
3楼2011-04-20 16:47:50
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yuxia82012

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励 2011-04-20 18:41:39
你是梯度做完后确定在60度最好是吧?后边扩增的话全用的60度,我有几个问题,就是你扩增产物说的跑电泳失败是只有引物二聚体条带吗?还是条带很弥散,在预期大小的地方有条带或者没有条带呢?如果只有引物二聚体的话,建议把温度降低点再扩增,还是没有的话很可能是模板不行了,得重新反转录做模板
在等待中涅槃重生
4楼2011-04-20 16:59:36
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