应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 怎P不出来呢？求解！
51/1返回列表
查看: 950  |  回复: 10
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

li1977li

金虫 (小有名气)

[求助] 怎P不出来呢？求解！

准备克隆表达一蛋白，从烟曲霉中提RNA反转录后先做梯度PCR（10ul-10管）得出最佳退火温度为60度，接下来想做胶回收却怎么也P不出来目的基因了（1.3kbp),用的是相同的试剂、条件，50ul,100ul体系，50ul分成5管，100ul分成10管最后混合跑电泳都失败，纠结啊盼请高手分析原因，谢谢！附梯度条件：94° 1min,94° 5s,60-70°90s,72° 90s,35cycles,72° 10min.用的是Taq酶PCR Green Mix。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2011-04-20 15:43:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

li1977li

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yuxia82012 at 2011-04-20 16:59:36:
你是梯度做完后确定在60度最好是吧？后边扩增的话全用的60度，我有几个问题，就是你扩增产物说的跑电泳失败是只有引物二聚体条带吗？还是条带很弥散，在预期大小的地方有条带或者没有条带呢？如果只有引物二聚体的 ...

后面扩增全是60度，电泳在100bp左右有很亮带应该是二聚体吧？而预期条带没有，请问降多少温度适宜啊?
赞一下 回复此楼
5楼2011-04-20 17:10:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 11 个回答

yuxia82012

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

Taq的退火时间不用那么长吧，我们都用30s，还有解链时间是不是短了点？第一步一般都是3min，后面循环时用的1min吧
赞一下 回复此楼
在等待中涅槃重生
2楼2011-04-20 16:23:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

li1977li

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yuxia82012 at 2011-04-20 16:23:34:
Taq的退火时间不用那么长吧，我们都用30s，还有解链时间是不是短了点？第一步一般都是3min，后面循环时用的1min吧

那为什么梯度做出而想大量扩增却没有呢？求解惑，谢谢！
赞一下 回复此楼
3楼2011-04-20 16:47:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yuxia82012

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励 2011-04-20 18:41:39
你是梯度做完后确定在60度最好是吧？后边扩增的话全用的60度，我有几个问题，就是你扩增产物说的跑电泳失败是只有引物二聚体条带吗？还是条带很弥散，在预期大小的地方有条带或者没有条带呢？如果只有引物二聚体的话，建议把温度降低点再扩增，还是没有的话很可能是模板不行了，得重新反转录做模板
赞一下(1人) 回复此楼
在等待中涅槃重生
4楼2011-04-20 16:59:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 11 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 315分求调剂 +3 26考研上岸版26 2026-03-26 3/150 2026-03-26 09:46 by 王笑宇一定是研�
[考研] 一志愿哈工大，085400，320，求调剂 +4 gdlf9999 2026-03-24 4/200 2026-03-25 23:01 by boxking200
[考研] 求调剂 +3 QiMing7 2026-03-25 3/150 2026-03-25 21:13 by 给你你注意休息
[考研] 材料与化工 322求调剂 +6 然11 2026-03-19 6/300 2026-03-25 18:37 by haxia
[考研] 284求调剂 +15 Zhao anqi 2026-03-22 15/750 2026-03-25 12:51 by wht0531
[考研] 0854电子信息求调剂 324 +4 Promise-jyl 2026-03-23 4/200 2026-03-25 11:36 by Sugarlight
[考研] B区考研调剂 +4 yqdszhdap－ 2026-03-22 5/250 2026-03-25 08:51 by baoball
[考研] 0856材料专硕353求调剂 +6 NIFFFfff 2026-03-20 6/300 2026-03-24 21:02 by hello七七
[考研] 一志愿北化315 求调剂 +3 akrrain 2026-03-24 3/150 2026-03-24 19:35 by 了了了了。。
[材料工程] 一志愿C9材料与化工专业总分300求调剂 +4 曼111 2026-03-24 5/250 2026-03-24 15:44 by 星空星月
[考研] 求调剂 +7 十三加油 2026-03-21 7/350 2026-03-23 23:48 by 热情沙漠
[论文投稿] 急发核心期刊论文 +3 贤达问津 2026-03-23 5/250 2026-03-23 17:13 by 妹子不好惹
[考研] 350求调剂 +6 weudhdk 2026-03-19 6/300 2026-03-23 15:47 by tangyuan0840221
[考研] 315分，诚求调剂，材料与化工085600 +3 13756423260 2026-03-22 3/150 2026-03-22 20:11 by edmund7
[考研] 一志愿华中科技大学071000，求调剂 +4 沿岸有贝壳6 2026-03-21 4/200 2026-03-22 07:21 by ilovexiaobin
[考研] 0703化学调剂 +4 妮妮ninicgb 2026-03-21 4/200 2026-03-21 18:39 by 学员8dgXkO
[基金申请] 学校已经提交到NSFC，还能修改吗？ 40+4 babangida 2026-03-19 9/450 2026-03-21 16:12 by babangida
[考研] 求调剂 +3 白QF 2026-03-21 3/150 2026-03-21 13:12 by zhukairuo
[考研] 332求调剂 +3 凤凰院丁真 2026-03-20 3/150 2026-03-21 10:27 by luoyongfeng
[考研] 320求调剂0856 +3 不想起名字112 2026-03-19 3/150 2026-03-19 22:53 by 学员8dgXkO
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭