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li1977li

金虫 (小有名气)

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[求助] 怎P不出来呢？求解！

准备克隆表达一蛋白，从烟曲霉中提RNA反转录后先做梯度PCR（10ul-10管）得出最佳退火温度为60度，接下来想做胶回收却怎么也P不出来目的基因了（1.3kbp),用的是相同的试剂、条件，50ul,100ul体系，50ul分成5管，100ul分成10管最后混合跑电泳都失败，纠结啊盼请高手分析原因，谢谢！附梯度条件：94° 1min,94° 5s,60-70°90s,72° 90s,35cycles,72° 10min.用的是Taq酶PCR Green Mix。

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1楼 2011-04-20 15:43:08

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li1977li

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引用回帖:

Originally posted by yuxia82012 at 2011-04-20 16:59:36:
你是梯度做完后确定在60度最好是吧？后边扩增的话全用的60度，我有几个问题，就是你扩增产物说的跑电泳失败是只有引物二聚体条带吗？还是条带很弥散，在预期大小的地方有条带或者没有条带呢？如果只有引物二聚体的 ...

后面扩增全是60度，电泳在100bp左右有很亮带应该是二聚体吧？而预期条带没有，请问降多少温度适宜啊?