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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 怎P不出来呢？求解！
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li1977li

金虫 (小有名气)

[求助] 怎P不出来呢？求解！

准备克隆表达一蛋白，从烟曲霉中提RNA反转录后先做梯度PCR（10ul-10管）得出最佳退火温度为60度，接下来想做胶回收却怎么也P不出来目的基因了（1.3kbp),用的是相同的试剂、条件，50ul,100ul体系，50ul分成5管，100ul分成10管最后混合跑电泳都失败，纠结啊盼请高手分析原因，谢谢！附梯度条件：94° 1min,94° 5s,60-70°90s,72° 90s,35cycles,72° 10min.用的是Taq酶PCR Green Mix。
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1楼 2011-04-20 15:43:08
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roomofxw

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
amisking(金币+1, EPI+1): 鼓励发帖应助。 2011-04-20 20:43:37
1.请验证模板是否OK
2.能否重复梯度PCR结果，包括PCR孔也要验证哦
3.是否是一管酶快用完了，剩下的活性不好了，或者不是同一批次的，可以做阳性对照
4.60-70度的梯度，确定是60度最佳，不科学啊，怎知降五度就不好呢？
5.应该保留梯度PCR产物，可以作为模板二次PCR；或者做阳性对照
重点检查模板，以及降低退火温度，不建议tag，保真性不好
说不定你梯度的那个孔在最边缘，设的六十度，实际只有58度……
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9楼2011-04-20 19:43:53
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yuxia82012

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

Taq的退火时间不用那么长吧，我们都用30s，还有解链时间是不是短了点？第一步一般都是3min，后面循环时用的1min吧
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在等待中涅槃重生
2楼2011-04-20 16:23:34
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li1977li

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yuxia82012 at 2011-04-20 16:23:34:
Taq的退火时间不用那么长吧，我们都用30s，还有解链时间是不是短了点？第一步一般都是3min，后面循环时用的1min吧

那为什么梯度做出而想大量扩增却没有呢？求解惑，谢谢！
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3楼2011-04-20 16:47:50
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yuxia82012

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励 2011-04-20 18:41:39
你是梯度做完后确定在60度最好是吧？后边扩增的话全用的60度，我有几个问题，就是你扩增产物说的跑电泳失败是只有引物二聚体条带吗？还是条带很弥散，在预期大小的地方有条带或者没有条带呢？如果只有引物二聚体的话，建议把温度降低点再扩增，还是没有的话很可能是模板不行了，得重新反转录做模板
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在等待中涅槃重生
4楼2011-04-20 16:59:36
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