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li1977li

金虫 (小有名气)

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虫号: 1121118
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性别: GG

[求助] 怎P不出来呢？求解！

准备克隆表达一蛋白，从烟曲霉中提RNA反转录后先做梯度PCR（10ul-10管）得出最佳退火温度为60度，接下来想做胶回收却怎么也P不出来目的基因了（1.3kbp),用的是相同的试剂、条件，50ul,100ul体系，50ul分成5管，100ul分成10管最后混合跑电泳都失败，纠结啊盼请高手分析原因，谢谢！附梯度条件：94° 1min,94° 5s,60-70°90s,72° 90s,35cycles,72° 10min.用的是Taq酶PCR Green Mix。

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1楼 2011-04-20 15:43:08

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roomofxw

木虫 (正式写手)

MolEPI: 5
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【答案】应助回帖

★
amisking(金币+1, EPI+1): 鼓励发帖应助。 2011-04-20 20:43:37

1.请验证模板是否OK
2.能否重复梯度PCR结果，包括PCR孔也要验证哦
3.是否是一管酶快用完了，剩下的活性不好了，或者不是同一批次的，可以做阳性对照
4.60-70度的梯度，确定是60度最佳，不科学啊，怎知降五度就不好呢？
5.应该保留梯度PCR产物，可以作为模板二次PCR；或者做阳性对照
重点检查模板，以及降低退火温度，不建议tag，保真性不好
说不定你梯度的那个孔在最边缘，设的六十度，实际只有58度……