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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 存档旧帖 » 线性化及完整的质粒电泳问题。
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111602

木虫 (著名写手)

[交流] 线性化及完整的质粒电泳问题。已有8人参与

最近在做实验过程中，遇到要将质粒先线性化，发现用酶切后电泳，与未酶切的质粒相比，跑的速度要快，不知是何原因，这些质粒都非空载，有些不理解，一般线性后跑的速度应该比超螺旋快才对啊。请高手指教！

首先感谢各位的讨论和建议。但必须说明一点，这个质粒是重组的，而且选择的酶只有一个酶切位点，电泳用的是1% AGAROSE GEL. 120V  30MIN.并且可以肯定已经被线性化的了。因为后继实验如果没有被线性化是无法成功的。


大家的回答都是建立在理论分析基础上的。我也赞同这一理论，但不知道有没有真正做过这一实验的朋友，可能我的实验（电泳）出了问题，但希望有实践经验的朋友给点意见。

[ Last edited by 111602 on 2011-4-21 at 01:42 ]
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1楼2011-04-20 08:28:01
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xiaoweiwei121

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这潭水蓝的深邃

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西瓜(金币+5, EPI+1): 太牛了！实践是检验真理的唯一标准哦！话说区长MM睡这么晚会长痘痘滴…… 2011-04-21 23:38:07
这个可不一定，也不要在什么情况下都说超螺旋跑的快，首先要搞清楚它为什么会跑的快，他有他的决定因素。并不是在任何情况下都是这样的。我们不是在比拼理论知识，而是为了解决我们试验中确实存在问题，我做过类似的
线性跑的比超螺旋要快
建议楼主换个0.7-0.8%胶跑一下看看（浓度一定要准哦），电压不用太高，看看结果如何，然后我们再来讨论
曾经看过一个解释：胶浓度小，则孔径大，超螺旋的跑的阻力小，就快些。而胶浓度大，则孔径小，超螺旋的跑的阻力大，就慢些。而线性片段的快慢与分子量有关，不受浓度的影响。 超螺旋的速度是可以变化的，与胶浓度有关，与分子量无关。
超螺旋的速度还和凝胶中的EB有关系（如果你没加的，那就算了）

我的一个实验图片，哪个是酶切的，哪个是质粒对照楼主应该能看出来
胶的浓度大于1%


[ Last edited by xiaoweiwei121 on 2011-4-21 at 03:27 ]
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18楼2011-04-21 03:04:06
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111602

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-04-20 09:02:49:
线性化以后应该跑的慢吧？应该比环状的大一些

这个可未必，也看到好多人反映这个问题。不知道有实际做过的没有。
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3楼2011-04-20 09:14:00
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天使托

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T.Shen
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1949stone(金币+2): 继续鼓励 看了 您说的对 2011-04-20 11:22:27
1949stone: 我也没理解 那个问题 哈哈脸红ing 2011-04-20 11:23:35
引用回帖:
Originally posted by xuguanghai at 2011-04-20 10:49:36:
http://zhidao.baidu.com/question/217768279.html?an=0&si=1

此链接说的不无道理，首先明确的是超螺旋是跑的最快的，可是线性和环状相比谁快一点，个人还是认为开环的跑得快。。。

详情请参见
基因操作原理第六版（Principles of Gene Manipulation）
瞿礼嘉 顾红雅 译
第45--47页
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9楼2011-04-20 11:03:31
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天使托

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T.Shen
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dhd997(金币+2): 有道理 2011-04-20 09:38:50
线性化以后应该跑的慢吧？应该比环状的大一些
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2楼2011-04-20 09:02:49
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天使托

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T.Shen
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1949stone(金币+2): 鼓励 2011-04-20 10:45:50
引用回帖:
Originally posted by 111602 at 2011-04-20 09:14:00:
这个可未必，也看到好多人反映这个问题。不知道有实际做过的没有。

什么叫未必如此？
质粒一般有三种状态，线性质粒；开环的；超螺旋的；一般前以最快的是超螺旋，其次是开环的，然后才是线性的。
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4楼2011-04-20 10:05:43
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xuguanghai

木虫 (职业作家)
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引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-04-20 10:05:43:
什么叫未必如此？
质粒一般有三种状态，线性质粒；开环的；超螺旋的；一般前以最快的是超螺旋，其次是开环的，然后才是线性的。

超螺旋>线形>开环,不是这个吗？
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5楼2011-04-20 10:31:29
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xuguanghai

木虫 (职业作家)
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1949stone(金币+2): 貌似 2011-04-20 10:46:07
引用回帖:
Originally posted by 111602 at 2011-04-20 08:28:01:
最近在做实验过程中，遇到要将质粒先线性化，发现用酶切后电泳，与未酶切的质粒相比，跑的速度要快，不知是何原因，这些质粒都非空载，有些不理解，一般线性后跑的速度应该比超螺旋快才对啊。请高手指教！

酶切后跑得快，应该是质粒变成片段了，看你质粒以及酶的关系了，还有
超螺旋>线形>开环，
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6楼2011-04-20 10:34:50
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天使托

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T.Shen
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dhd997(金币+2): 你是对的 2011-04-20 10:51:17
引用回帖:
Originally posted by xuguanghai at 2011-04-20 10:31:29:
超螺旋>线形>开环,不是这个吗？

http://zhidao.baidu.com/question/211352024.html
你觉得呢？超螺旋是跑的最快滴！
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7楼2011-04-20 10:37:47
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xuguanghai

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dhd997(金币+2): 有理有据，欢迎交流 2011-04-20 10:51:34
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-04-20 10:37:47:
http://zhidao.baidu.com/question/211352024.html
你觉得呢？超螺旋是跑的最快滴！

http://zhidao.baidu.com/question/217768279.html?an=0&si=1
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8楼2011-04-20 10:49:36
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xuguanghai

木虫 (职业作家)
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引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-04-20 11:03:31:
此链接说的不无道理，首先明确的是超螺旋是跑的最快的，可是线性和环状相比谁快一点，个人还是认为开环的跑得快。。。

详情请参见
基因操作原理第六版（Principles of Gene Manipulation）
瞿礼嘉 顾红雅 ...

恩，谢谢，去看看
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10楼2011-04-20 11:06:52
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