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111602木虫 (著名写手)
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[交流]
线性化及完整的质粒电泳问题。 已有8人参与
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最近在做实验过程中，遇到要将质粒先线性化，发现用酶切后电泳，与未酶切的质粒相比，跑的速度要快，不知是何原因，这些质粒都非空载，有些不理解，一般线性后跑的速度应该比超螺旋快才对啊。请高手指教！ 首先感谢各位的讨论和建议。但必须说明一点，这个质粒是重组的，而且选择的酶只有一个酶切位点，电泳用的是1% AGAROSE GEL. 120V 30MIN.并且可以肯定已经被线性化的了。因为后继实验如果没有被线性化是无法成功的。 大家的回答都是建立在理论分析基础上的。我也赞同这一理论，但不知道有没有真正做过这一实验的朋友，可能我的实验（电泳）出了问题，但希望有实践经验的朋友给点意见。 [ Last edited by 111602 on 2011-4-21 at 01:42 ] |
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xiaoweiwei121
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+5, EPI+1): 太牛了！实践是检验真理的唯一标准哦！话说区长MM睡这么晚会长痘痘滴…… 2011-04-21 23:38:07
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+5, EPI+1): 太牛了！实践是检验真理的唯一标准哦！话说区长MM睡这么晚会长痘痘滴…… 2011-04-21 23:38:07
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这个可不一定，也不要在什么情况下都说超螺旋跑的快，首先要搞清楚它为什么会跑的快，他有他的决定因素。并不是在任何情况下都是这样的。我们不是在比拼理论知识，而是为了解决我们试验中确实存在问题，我做过类似的 线性跑的比超螺旋要快 建议楼主换个0.7-0.8%胶跑一下看看（浓度一定要准哦），电压不用太高，看看结果如何，然后我们再来讨论 曾经看过一个解释：胶浓度小，则孔径大，超螺旋的跑的阻力小，就快些。而胶浓度大，则孔径小，超螺旋的跑的阻力大，就慢些。而线性片段的快慢与分子量有关，不受浓度的影响。 超螺旋的速度是可以变化的，与胶浓度有关，与分子量无关。 超螺旋的速度还和凝胶中的EB有关系（如果你没加的，那就算了） 我的一个实验图片，哪个是酶切的，哪个是质粒对照楼主应该能看出来 胶的浓度大于1%  [ Last edited by xiaoweiwei121 on 2011-4-21 at 03:27 ] |
18楼2011-04-21 03:04:06
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3楼2011-04-20 09:14:00
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