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b529941390木虫 (正式写手)
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[求助]
关于质粒提取
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最近问老外要了个质粒，他们在大肠杆菌DH5α里面做的表达。 拿到质粒之后，做了PCR，看到条带和目的片段的大小相同，然后就将质粒转化到了买好的DH5α感受态细胞中，涂板之后挑取单菌落，菌落PCR和提取的质粒做PCR都有条带，下面是PCR产物的电泳图，从左到右一次是阴性对照，阳性对照，三个样品和一个marker  但是现在遇到了一个问题： 我的质粒提取的浓度很低很低！ 尝试着用了2mL、10mL和30mL的菌液提取质粒，但是质粒的浓度都很低！ 使用的洗脱液的体积是30uL，跑了1uL的DNA电泳，除了10mL的有很弱的条带之外，其它的都没有条带，后来我去别的实验室借了一个正常的高拷贝菌，作为阳性对照，再次提取质粒，发现阳性对照出来了，但是我的质粒还是看不到！ 下面是10mL的菌液提取质粒后的DNA电泳图，从左到右一次是两个marker和三个样品，可以很艰难的看到在最大bp上面>500bp,的地方，样品有弱条带(质粒总大小大概是5000-6000bp)  然后我又将高拷贝质粒的细菌作为阳性对照，同样提取质粒，然后做了DNA电泳： 左边两个是marker，0#就是我的阳性对照的高拷贝菌提取的质粒，后面都是样品  可以看到，基本上看不到样品质粒的条带，然后就没有办法测序。 现在我的问题是： 我的质粒拷贝数很低，提出的质粒浓度那么低，怎么测序呢？如果不能测序，我能往下做诱导么？ 还有就是，如果质粒的拷贝数这么低，那么我将来做诱导表达的时候，还能够在DH5α里面做么？ 期待高手回复，谢谢！ |
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b529941390
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3楼2011-04-18 13:45:24
roomofxw
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【答案】应助回帖
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b529941390(金币+50): 10 2011-04-18 13:42:24
dhd997(金币+6, EPI+1): good 2011-04-18 14:37:41
b529941390(金币+50): 10 2011-04-18 13:42:24
dhd997(金币+6, EPI+1): good 2011-04-18 14:37:41
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可以，表达最常用的pET系统，拷贝数就很低，但是完全不限制他的广泛使用 想要提高质粒提取浓度，也有办法 1.小提上多摸索一些条件，感觉养菌时间有时候对质粒提取的影响不小。 2.可以摇几个小时后，加一点氯霉素，可以比较明显的增加提取量。 3.真不行，就多提几管，然后乙醇沉淀，浓缩。 另外，测序，没问题，把菌给公司，让他们提质粒测序，测不出来使他们的事情。另外低拷贝测序没什么问题 再附，能不能在DH5a表达，与拷贝数无关，和质粒上的启动子之类元件有关。很多载体都可以在DH5a中表达，当然作为常见的克隆宿主菌，它并不一定是表达最合适的菌株 |
2楼2011-04-18 13:09:31
roomofxw
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【答案】应助回帖
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dhd997(金币+5): good 2011-04-18 18:48:24
dhd997(金币+5): good 2011-04-18 18:48:24
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哦，你是说takara是吧，那也没问题，我在北京也是用宝生物测序的，低拷贝的pET载体，提了一点质粒给他们，由他们转化后，再提取质粒测序的。 DH5a一般是作为克隆宿主，但是也能表达用，和质粒有关了 您要使用pET，那一般采用BL21(DE3)类的 pGEX，一般也用BL21 pQE系列，就是M15菌了 我用过pBAD系列的质粒，放在DH5a表达，也很OK，表达量没有问题。 但是基本原理，还是需要试验验证，您只有做了才知道。表达和质粒，宿主，基因，蛋白，表达条件等都很有关系，不好说 |
4楼2011-04-18 13:57:49
b529941390
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5楼2011-04-18 14:30:59
