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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】连接实验假阳性加多如何解决
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yuyan225

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】连接实验假阳性加多如何解决

如题，我在连表达载体的时候载体与片段的摩尔比用了1:8，能长出好多菌落，但在进行菌落PCR的时候全部都是假阳性，我已经P了40多个菌落都是假阳性~~~忘各位虫友不吝赐教，谢谢！！
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1楼 2011-04-10 16:02:21
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★
yuyan225(金币+1):谢谢参与
西瓜(金币+3, EPI+1): 高手就是高手 2011-04-12 10:47:06
yuyan225(金币+3): 2011-04-12 15:34:30
载体酶切不完全，去磷酸化是无法解决的…………
酶切不完全的意思是，根本没切开，或者双切只切了其中一段
其实最好的解决方案是，买好一点的内切酶（NEB、Fermentas），切够时间（按照酶活定义计算，再延长一些），然后跑胶回收

我这样做出来的几乎都是阳性克隆，我都不做PCR了，直接测序个个阳性

其实在内切酶那里省钱，后面做菌落PCR就要花钱花时间了。
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3楼2011-04-11 08:59:02
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普通回帖

zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
yuyan225(金币+1):谢谢参与
西瓜(金币+3): 去磷是好办法。夜深了，早点休息哦~ 2011-04-10 23:57:30
西瓜(金币+2, EPI+1): 鼓励，继续加油啊！ 2011-04-12 10:47:41
引用回帖:
Originally posted by yuyan225 at 2011-04-10 16:02:21:
如题，我在连表达载体的时候载体与片段的摩尔比用了1:8，能长出好多菌落，但在进行菌落PCR的时候全部都是假阳性，我已经P了40多个菌落都是假阳性~~~忘各位虫友不吝赐教，谢谢！！

遇见过这样的问题。

片段多，载体少，这样的比例没有问题，也可以1：10。

最常见的原因是载体酶切不完全，导致载体自连。通常有两种解决方法：

1、用碱性磷酸酶处理，消化掉5‘端磷酸基团，防止载体自连。但在lz现有的条件下可能会造成阳性率偏低。

2、个人认为最好的解决方法：增加载体酶切的时间。既然是做连接，那应该是保证片段方向的双酶切，不知lz用的什么酶切体系，酶切多长时间？可以尝试酶切时间增加到24小时。

祝lz顺利、好运！
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2楼2011-04-10 23:49:46
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roomofxw

木虫 (正式写手)
★
yuyan225(金币+1):谢谢参与
双酶切去磷酸化能很好的防止自连
菌落PCR没有什么问题么？
平板抗性还OK么……

上面是在键盘上随机敲出来的
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5楼2011-04-11 09:07:26
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
yuyan225(金币+1):谢谢参与
西瓜(金币+3): 鼓励 2011-04-11 14:20:17
引用回帖:
Originally posted by yuyan225 at 2011-04-10 16:02:21:
如题，我在连表达载体的时候载体与片段的摩尔比用了1:8，能长出好多菌落，但在进行菌落PCR的时候全部都是假阳性，我已经P了40多个菌落都是假阳性~~~忘各位虫友不吝赐教，谢谢！！

从你的叙述来看不是你的载体片段比例问题，而是载体出问题了，解决方法如下：
（1）载体如果是单酶切，割胶回收后做一步去磷酸化
（2）如果是双酶切，请分别做单酶切验证，看是不是酶质量有问题。或者是两个酶切位点比较近，导致一种酶无法正常切割
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6楼2011-04-11 13:53:42
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susizheng

木虫 (著名写手)
★
yuyan225(金币+1):谢谢参与
yuyan225(金币+2): 谢谢 2011-04-12 15:39:34
摩尔比是这样没错，长了太多，应该是你连接时载体量加太多了，一般连接体系里面有10~20 ng的载体就够了。酶切的时候载体量也不要加太多，这样酶切就不完全了。
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7楼2011-04-12 10:28:54
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yuyan225

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zhaohq1209 at 2011-04-10 23:49:46:
遇见过这样的问题。

片段多，载体少，这样的比例没有问题，也可以1：10。

最常见的原因是载体酶切不完全，导致载体自连。通常有两种解决方法：

1、用碱性磷酸酶处理，消化掉5‘端磷酸基团，防止载体自 ...

按您的建议做了，又长了好多菌落，期待有好结果~~非常感谢！！
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8楼2011-04-12 15:34:01
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yuyan225

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by roomofxw at 2011-04-11 09:07:26:
双酶切去磷酸化能很好的防止自连
菌落PCR没有什么问题么？
平板抗性还OK么……

上面是在键盘上随机敲出来的

都做过对照，菌落PCR和抗性板都OK的，其他载体都连上了，就差一个~~~
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9楼2011-04-12 15:35:53
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yuyan225

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 空谷幽风 at 2011-04-11 13:53:42:
从你的叙述来看不是你的载体片段比例问题，而是载体出问题了，解决方法如下：
（1）载体如果是单酶切，割胶回收后做一步去磷酸化
（2）如果是双酶切，请分别做单酶切验证，看是不是酶质量有问题。或者是两个酶 ...

请问如果两个酶切位点太近不能切开，这种情况如何检测呢
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10楼2011-04-12 15:38:43
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by yuyan225 at 2011-04-12 15:38:43:
请问如果两个酶切位点太近不能切开，这种情况如何检测呢

如果非得选择两个太近的位点，分步酶切如何？
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11楼2011-04-12 15:40:56
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yuyan225

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2011-04-11 08:59:02:
载体酶切不完全，去磷酸化是无法解决的…………
酶切不完全的意思是，根本没切开，或者双切只切了其中一段
其实最好的解决方案是，买好一点的内切酶（NEB、Fermentas），切够时间（按照酶活定义计算，再延长一些 ...

挺有道理的，谢谢您了！
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12楼2011-04-12 15:42:06
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yuyan225

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zhaohq1209 at 2011-04-12 15:40:56:
如果非得选择两个太近的位点，分步酶切如何？

应该可行，谢谢~~
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13楼2011-04-12 15:44:48
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
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西瓜(金币+2): 鼓励 2011-04-12 18:28:16
引用回帖:
Originally posted by yuyan225 at 2011-04-12 15:38:43:
请问如果两个酶切位点太近不能切开，这种情况如何检测呢

你不会连载体的序列信息都不知道吧，那你怎么确定的酶切位点？把载体序列放到vector nti里找找这两个酶切位点间间隔多少碱基，然后再查一下这两种酶完全酶切所需要的最少碱基数就知道能不能切开了。关于酶切的问题请参考我写的这篇文章http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=3069329&fpage=1
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14楼2011-04-12 16:21:49
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meizishu

禁虫 (小有名气)
★
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本帖内容被屏蔽
15楼2011-04-12 18:23:36
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by meizishu at 2011-04-12 18:23:36:
takara的内切酶怎么样？

takara的酶性价比比较高。

但还是NEB的最好
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16楼2011-04-12 21:50:37
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yuyan225

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 空谷幽风 at 2011-04-12 16:21:49:
你不会连载体的序列信息都不知道吧，那你怎么确定的酶切位点？把载体序列放到vector nti里找找这两个酶切位点间间隔多少碱基，然后再查一下这两种酶完全酶切所需要的最少碱基数就知道能不能切开了。关于酶切的问 ...

非常谢谢您，我的意思是假设在实际操作中，进行酶切的时候做了单酶切对照，发现没有切开，此时我如何去判断是只切开了一边，还是两边都没有切开~~
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17楼2011-04-12 22:40:28
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
西瓜(金币+5): 不错不错，克隆专家呢。 2011-04-14 12:08:47
引用回帖:
Originally posted by yuyan225 at 2011-04-12 22:40:28:
非常谢谢您，我的意思是假设在实际操作中，进行酶切的时候做了单酶切对照，发现没有切开，此时我如何去判断是只切开了一边，还是两边都没有切开~~

哦，是这样的，做完单酶切对照后带着完整的质粒跑个胶就能分别出哪种酶有问题了（切开了是单一条带，切不开的跟质粒带型一样）。还有如果知道两个酶切位点之间的碱基数少于那两种酶能够完全酶切所需的最少保护碱基数之和，那么一般认为不能发生完全酶切
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18楼2011-04-13 11:00:07
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yuyan225

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 空谷幽风 at 2011-04-13 11:00:07:
哦，是这样的，做完单酶切对照后带着完整的质粒跑个胶就能分别出哪种酶有问题了（切开了是单一条带，切不开的跟质粒带型一样）。还有如果知道两个酶切位点之间的碱基数少于那两种酶能够完全酶切所需的最少保护碱 ...

学习了，非常感谢
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19楼2011-04-14 11:26:04
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alice

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2011-04-11 08:59:02:
载体酶切不完全，去磷酸化是无法解决的…………
酶切不完全的意思是，根本没切开，或者双切只切了其中一段
其实最好的解决方案是，买好一点的内切酶（NEB、Fermentas），切够时间（按照酶活定义计算，再延长一些 ...

我也做双酶切，连接，以前还长假阳性的，也曾经连上过，不过最近做，连假阳性也不长了，是怎么回事呢？
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20楼2011-12-03 16:20:35
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maym3

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
561030楼: Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2011-04-11 08:59:02
载体酶切不完全，去磷酸化是无法解决的…………
酶切不完全的意思是，根本没切开，或者双切只切了其中一段
其实最好的解决方案是，买好一点的内切酶（NEB、Fermentas），切够时间（按照酶活定义计算，再延长一些） ...

求助32a载体自连接，怎么避免
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21楼2013-03-02 13:28:23
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zhaohq12094楼
2011-04-11 09:00   回复  
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2011-04-11 08:59:02: 载体酶切不完全，去磷酸化是无法解决的………… 酶切不完全的意思是，根本没切开，或者双切只切了其中一段 其实最好的解决方案是，买好一点的内切酶（NEB、Fermentas），切够时间（按照酶活定义计算，再延长一些 ...

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