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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】连接实验假阳性加多如何解决
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yuyan225

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】连接实验假阳性加多如何解决

如题，我在连表达载体的时候载体与片段的摩尔比用了1:8，能长出好多菌落，但在进行菌落PCR的时候全部都是假阳性，我已经P了40多个菌落都是假阳性~~~忘各位虫友不吝赐教，谢谢！！
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1楼 2011-04-10 16:02:21
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
西瓜(金币+5): 不错不错，克隆专家呢。 2011-04-14 12:08:47
引用回帖:
Originally posted by yuyan225 at 2011-04-12 22:40:28:
非常谢谢您，我的意思是假设在实际操作中，进行酶切的时候做了单酶切对照，发现没有切开，此时我如何去判断是只切开了一边，还是两边都没有切开~~

哦，是这样的，做完单酶切对照后带着完整的质粒跑个胶就能分别出哪种酶有问题了（切开了是单一条带，切不开的跟质粒带型一样）。还有如果知道两个酶切位点之间的碱基数少于那两种酶能够完全酶切所需的最少保护碱基数之和，那么一般认为不能发生完全酶切
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18楼2011-04-13 11:00:07
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
yuyan225(金币+1):谢谢参与
西瓜(金币+3): 去磷是好办法。夜深了，早点休息哦~ 2011-04-10 23:57:30
西瓜(金币+2, EPI+1): 鼓励，继续加油啊！ 2011-04-12 10:47:41
引用回帖:
Originally posted by yuyan225 at 2011-04-10 16:02:21:
如题，我在连表达载体的时候载体与片段的摩尔比用了1:8，能长出好多菌落，但在进行菌落PCR的时候全部都是假阳性，我已经P了40多个菌落都是假阳性~~~忘各位虫友不吝赐教，谢谢！！

遇见过这样的问题。

片段多，载体少，这样的比例没有问题，也可以1：10。

最常见的原因是载体酶切不完全，导致载体自连。通常有两种解决方法：

1、用碱性磷酸酶处理，消化掉5‘端磷酸基团，防止载体自连。但在lz现有的条件下可能会造成阳性率偏低。

2、个人认为最好的解决方法：增加载体酶切的时间。既然是做连接，那应该是保证片段方向的双酶切，不知lz用的什么酶切体系，酶切多长时间？可以尝试酶切时间增加到24小时。

祝lz顺利、好运！
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2楼2011-04-10 23:49:46
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★
yuyan225(金币+1):谢谢参与
西瓜(金币+3, EPI+1): 高手就是高手 2011-04-12 10:47:06
yuyan225(金币+3): 2011-04-12 15:34:30
载体酶切不完全，去磷酸化是无法解决的…………
酶切不完全的意思是，根本没切开，或者双切只切了其中一段
其实最好的解决方案是，买好一点的内切酶（NEB、Fermentas），切够时间（按照酶活定义计算，再延长一些），然后跑胶回收

我这样做出来的几乎都是阳性克隆，我都不做PCR了，直接测序个个阳性

其实在内切酶那里省钱，后面做菌落PCR就要花钱花时间了。
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3楼2011-04-11 08:59:02
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roomofxw

木虫 (正式写手)
★
yuyan225(金币+1):谢谢参与
双酶切去磷酸化能很好的防止自连
菌落PCR没有什么问题么？
平板抗性还OK么……

上面是在键盘上随机敲出来的
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5楼2011-04-11 09:07:26
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zhaohq12094楼
2011-04-11 09:00   回复  
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2011-04-11 08:59:02: 载体酶切不完全，去磷酸化是无法解决的………… 酶切不完全的意思是，根本没切开，或者双切只切了其中一段 其实最好的解决方案是，买好一点的内切酶（NEB、Fermentas），切够时间（按照酶活定义计算，再延长一些 ...

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