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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】连接实验假阳性加多如何解决
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yuyan225

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】连接实验假阳性加多如何解决

如题，我在连表达载体的时候载体与片段的摩尔比用了1:8，能长出好多菌落，但在进行菌落PCR的时候全部都是假阳性，我已经P了40多个菌落都是假阳性~~~忘各位虫友不吝赐教，谢谢！！
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1楼2011-04-10 16:02:21
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★
yuyan225(金币+1):谢谢参与
西瓜(金币+3, EPI+1): 高手就是高手 2011-04-12 10:47:06
yuyan225(金币+3): 2011-04-12 15:34:30
载体酶切不完全，去磷酸化是无法解决的…………
酶切不完全的意思是，根本没切开，或者双切只切了其中一段
其实最好的解决方案是，买好一点的内切酶（NEB、Fermentas），切够时间（按照酶活定义计算，再延长一些），然后跑胶回收

我这样做出来的几乎都是阳性克隆，我都不做PCR了，直接测序个个阳性

其实在内切酶那里省钱，后面做菌落PCR就要花钱花时间了。
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3楼2011-04-11 08:59:02
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
yuyan225(金币+1):谢谢参与
西瓜(金币+3): 去磷是好办法。夜深了，早点休息哦~ 2011-04-10 23:57:30
西瓜(金币+2, EPI+1): 鼓励，继续加油啊！ 2011-04-12 10:47:41
引用回帖:
Originally posted by yuyan225 at 2011-04-10 16:02:21:
如题，我在连表达载体的时候载体与片段的摩尔比用了1:8，能长出好多菌落，但在进行菌落PCR的时候全部都是假阳性，我已经P了40多个菌落都是假阳性~~~忘各位虫友不吝赐教，谢谢！！

遇见过这样的问题。

片段多，载体少，这样的比例没有问题，也可以1：10。

最常见的原因是载体酶切不完全，导致载体自连。通常有两种解决方法：

1、用碱性磷酸酶处理，消化掉5‘端磷酸基团，防止载体自连。但在lz现有的条件下可能会造成阳性率偏低。

2、个人认为最好的解决方法：增加载体酶切的时间。既然是做连接，那应该是保证片段方向的双酶切，不知lz用的什么酶切体系，酶切多长时间？可以尝试酶切时间增加到24小时。

祝lz顺利、好运！
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2楼2011-04-10 23:49:46
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roomofxw

木虫 (正式写手)
★
yuyan225(金币+1):谢谢参与
双酶切去磷酸化能很好的防止自连
菌落PCR没有什么问题么？
平板抗性还OK么……

上面是在键盘上随机敲出来的
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5楼2011-04-11 09:07:26
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
yuyan225(金币+1):谢谢参与
西瓜(金币+3): 鼓励 2011-04-11 14:20:17
引用回帖:
Originally posted by yuyan225 at 2011-04-10 16:02:21:
如题，我在连表达载体的时候载体与片段的摩尔比用了1:8，能长出好多菌落，但在进行菌落PCR的时候全部都是假阳性，我已经P了40多个菌落都是假阳性~~~忘各位虫友不吝赐教，谢谢！！

从你的叙述来看不是你的载体片段比例问题，而是载体出问题了，解决方法如下：
（1）载体如果是单酶切，割胶回收后做一步去磷酸化
（2）如果是双酶切，请分别做单酶切验证，看是不是酶质量有问题。或者是两个酶切位点比较近，导致一种酶无法正常切割
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6楼2011-04-11 13:53:42
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zhaohq12094楼
2011-04-11 09:00   回复  
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2011-04-11 08:59:02: 载体酶切不完全，去磷酸化是无法解决的………… 酶切不完全的意思是，根本没切开，或者双切只切了其中一段 其实最好的解决方案是，买好一点的内切酶（NEB、Fermentas），切够时间（按照酶活定义计算，再延长一些 ...

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