| 查看: 2848 | 回复: 12 | |||
| 本帖产生 1 个 BioEPI ，点击这里进行查看 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
[交流]
【求助】几个关于实时定量PCR的问题
|
|||
|
在PCR条件优化时，以什么为模板呢，含目的片段的质粒？cDNA？还是基因组？还是都可以呢？ 熔接曲线能区分引物二聚体和非特异性条带吗？ |
回复此楼» 猜你喜欢
能否退出参与的面上项目解除限项
已经有6人回复
-
什么时候开奖？
已经有11人回复
-
范进中举一文的中心思想
已经有6人回复
-
建议基金发布提前给出明确的时间点
已经有14人回复
-
2026国自然函评费到账
已经有17人回复
-
让我中一个面上吧！
已经有15人回复
-
2026年的国家社科基金项目通讯评审的新规则与新动向、新挑战
已经有5人回复
-
跳槽后在研项目怎么办？
已经有10人回复
-
今天放榜吗？
已经有16人回复
-
93BebMhtakh前后11位开头都是大写
已经有8人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 实时荧光定量PCR仪器使用问题
已经有5人回复
- 【求助/交流】关于荧光定量PCR的一个问题
已经有3人回复
- 【求助/交流】求助关于实时定量PCR
已经有8人回复
- 【求助/交流】关于做荧光定量pcr的模板问题
已经有12人回复
- 【求助/交流】实时荧光定量pcr的问题
已经有7人回复
» 抢金币啦！回帖就可以得到:
-
每年这时候我都再仔细读一遍《范进中举》
+1/472
-
面上第三年申请，改了一遍又一遍，希望能中啊！散金祈福！！！
+5/395
-
基金申请小调查！预祝申请必定中中中！！祈福！！！
+5/245
-
散金求好运
+1/190
-
五大联赛看好哪支球队
+5/175
-
坐标北京诚征男友
+1/112
-
Polymers 期刊特刊 组稿
+1/75
-
那年春暖花开，今朝如梦初醒 —— 北漂十五载，相亲十年，归乡孑然一身
+1/66
-
焦虑
+1/64
-
哈尔滨工业大学（校本部）电子与信息工程学院2027级博士招生
+1/63
-
上海交通大学张航课题组招聘博士后（电化学能量存储与转换）
+1/43
-
强耀生物金秋开学季活动，2026年8月18日-10月31日，肽库筛选低至2W5
+3/37
-
瑞典-博后-固态电池-粘结剂-锂离子电池方向
+1/34
-
南京理工大学优青团队催化化学方向招收推免研究生
+1/22
-
流放岭南浮肿了求救
+1/20
-
***大叔找对象（沪深等地）
+1/20
-
上海交通大学化学化工学院倪伟焱课题组招收2027年申请考核制博士生（电催化+高分子）
+1/12
-
北理工集成电路杰青团队 | 诚招科助理
+1/11
-
祈祷老公中国基
+1/4
-
找女友
+1/1
★
nininini(金币+1):谢谢参与
nininini(金币+6): 2011-04-07 10:36:07
nininini(金币+1):谢谢参与
nininini(金币+6): 2011-04-07 10:36:07
|
通常不会用质粒去优化。 1. 不是每个基因你都有对应的质粒。 2. 质粒优化产生的PCR条件虽然大多数情况下可以直接用于cDNA或基因组PCR，但是你还需要做具体实验微环境下的标准曲线。reviewer 不会放你过关。意思就是你优化完了条件，还要用cDNA或genomic做一次标准曲线，看看扩增效率和线性范围是否达到要求。 3. 纯质粒很难产生非特异性扩增，你不能检测引物特异性。无法保证实验中不会产生非特异性扩增，如果有了非特异性扩增，你必须改变条件，条件变了，又要重新优化。 4. 逆转录价格并不贵。通常都是一次性反转录大量cDNA，然后酒精沉淀纯化，分装冻存，用于制作标准曲线和条件优化。一次正交设计就能解决问题。 5. 质粒需线性化才能达到理想扩增效果。 |
7楼2011-04-06 23:11:20
★
nininini(金币+1):谢谢参与
nininini(金币+4): 2011-04-06 19:18:55
nininini(金币+1):谢谢参与
nininini(金币+4): 2011-04-06 19:18:55
|
质粒比cDNA和基因组DNA更容易获得，所以要优化PCR，可以用质粒作模板。 融解曲线可以区分的。融解曲线的峰会告诉你有多少种产物，峰的位置(横坐标，温度）指示了这些产物各自的熔解温度。假如只有一个峰，就是特异产物啦（tm值符合设计引物时分析的结果）。引物二聚体因为片段小，tm值也小，峰会比较靠前。非特异条带则不一定。 因为特异产物得到的良好扩增，所以它的峰是最高的（纵坐标，荧光信号强度）。引物二聚体和非特异条带的峰一般比较低。 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
cnb19873楼2011-04-06 19:12:08
4楼2011-04-06 19:21:37
★ ★
amisking(金币+2, EPI+1): 鼓励发帖交流。 2011-04-06 19:46:07
amisking(金币+2, EPI+1): 鼓励发帖交流。 2011-04-06 19:46:07
|
差别不大，最关键的是cDNA要做反转录，反转录酶很贵啊……所以一般都用质粒优化。 如果用的是sybr green一类的荧光染料，引物二聚体会影响荧光定量PCR的结果的。sybr green可以非特异地和双链DNA结合，不管是目的产物、引物二聚体还是非特异产物，都可以产生荧光信号，而仪器是不能区分它们的信号的，所以引物二聚体和非特异产物会干扰定量结果。 可以试着提高退火温度，看看能不能减少引物二聚体。有没有二聚体就看融解曲线好了，跑胶的话，看不出是残余的引物还是引物二聚体。 |
5楼2011-04-06 19:32:57
简单回复
2011-04-06 23:16
回复
nininini(金币+1):谢谢参与
xiaogenv11楼
2011-04-09 09:57
回复
nininini(金币+1):谢谢参与
