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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 【求助】几个关于实时定量PCR的问题
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nininini

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助】几个关于实时定量PCR的问题

在PCR条件优化时，以什么为模板呢，含目的片段的质粒？cDNA？还是基因组？还是都可以呢？
熔接曲线能区分引物二聚体和非特异性条带吗？
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1楼 2011-04-06 18:46:47
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65900931

银虫 (小有名气)
★
nininini(金币+1):谢谢参与
nininini(金币+6): 2011-04-07 10:36:07
通常不会用质粒去优化。
1. 不是每个基因你都有对应的质粒。
2. 质粒优化产生的PCR条件虽然大多数情况下可以直接用于cDNA或基因组PCR，但是你还需要做具体实验微环境下的标准曲线。reviewer 不会放你过关。意思就是你优化完了条件，还要用cDNA或genomic做一次标准曲线，看看扩增效率和线性范围是否达到要求。
3. 纯质粒很难产生非特异性扩增，你不能检测引物特异性。无法保证实验中不会产生非特异性扩增，如果有了非特异性扩增，你必须改变条件，条件变了，又要重新优化。
4. 逆转录价格并不贵。通常都是一次性反转录大量cDNA，然后酒精沉淀纯化，分装冻存，用于制作标准曲线和条件优化。一次正交设计就能解决问题。
5. 质粒需线性化才能达到理想扩增效果。
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7楼2011-04-06 23:11:20
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★
nininini(金币+1):谢谢参与
nininini(金币+4): 2011-04-06 19:18:55
引用回帖:
Originally posted by nininini at 2011-04-06 18:46:47:
在PCR条件优化时，以什么为模板呢，含目的片段的质粒？cDNA？还是基因组？还是都可以呢？
熔接曲线能区分引物二聚体和非特异性条带吗？

质粒比cDNA和基因组DNA更容易获得，所以要优化PCR，可以用质粒作模板。
融解曲线可以区分的。融解曲线的峰会告诉你有多少种产物，峰的位置(横坐标，温度）指示了这些产物各自的熔解温度。假如只有一个峰，就是特异产物啦（tm值符合设计引物时分析的结果）。引物二聚体因为片段小，tm值也小，峰会比较靠前。非特异条带则不一定。
因为特异产物得到的良好扩增，所以它的峰是最高的（纵坐标，荧光信号强度）。引物二聚体和非特异条带的峰一般比较低。
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cnb1987
3楼2011-04-06 19:12:08
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nininini

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-04-06 19:12:08:
质粒比cDNA和基因组DNA更容易获得，所以要优化PCR，可以用质粒作模板。
融解曲线可以区分的。融解曲线的峰会告诉你有多少种产物，峰的位置(横坐标，温度）指示了这些产物各自的熔解温度。假如只有一个峰，就是 ...

谢谢，回复的很详细~~
但是我还是有一些疑问: 质粒为模板优化的条件与以cDNA为模板的扩增条件能保持一致吗？另外，如果是引物二聚体而不是非特异性扩增的话会影响我的实时定量结果吗？
谢谢~~
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4楼2011-04-06 19:21:37
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★ ★
amisking(金币+2, EPI+1): 鼓励发帖交流。 2011-04-06 19:46:07
引用回帖:
Originally posted by nininini at 2011-04-06 19:21:37:
谢谢，回复的很详细~~
但是我还是有一些疑问: 质粒为模板优化的条件与以cDNA为模板的扩增条件能保持一致吗？另外，如果是引物二聚体而不是非特异性扩增的话会影响我的实时定量结果吗？
谢谢~~

差别不大，最关键的是cDNA要做反转录，反转录酶很贵啊……所以一般都用质粒优化。
如果用的是sybr green一类的荧光染料，引物二聚体会影响荧光定量PCR的结果的。sybr green可以非特异地和双链DNA结合，不管是目的产物、引物二聚体还是非特异产物，都可以产生荧光信号，而仪器是不能区分它们的信号的，所以引物二聚体和非特异产物会干扰定量结果。
可以试着提高退火温度，看看能不能减少引物二聚体。有没有二聚体就看融解曲线好了，跑胶的话，看不出是残余的引物还是引物二聚体。
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5楼2011-04-06 19:32:57
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blackrose80898楼
2011-04-06 23:16   回复  
nininini(金币+1):谢谢参与
引用回帖:
Originally posted by 65900931 at 2011-04-06 23:11:20: 通常不会用质粒去优化。 1. 不是每个基因你都有对应的质粒。 2. 质粒优化产生的PCR条件虽然大多数情况下可以直接用于cDNA或基因组PCR，但是你还需要做具体实验微环境下的标准曲线。reviewer 不会放你过关。意思 ...

xiaogenv11楼
2011-04-09 09:57   回复  
nininini(金币+1):谢谢参与
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