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【求助】几个关于实时定量PCR的问题
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在PCR条件优化时，以什么为模板呢，含目的片段的质粒？cDNA？还是基因组？还是都可以呢？ 熔接曲线能区分引物二聚体和非特异性条带吗？ |
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nininini(金币+1):谢谢参与
nininini(金币+4): 2011-04-06 19:18:55
nininini(金币+1):谢谢参与
nininini(金币+4): 2011-04-06 19:18:55
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质粒比cDNA和基因组DNA更容易获得，所以要优化PCR，可以用质粒作模板。 融解曲线可以区分的。融解曲线的峰会告诉你有多少种产物，峰的位置(横坐标，温度）指示了这些产物各自的熔解温度。假如只有一个峰，就是特异产物啦（tm值符合设计引物时分析的结果）。引物二聚体因为片段小，tm值也小，峰会比较靠前。非特异条带则不一定。 因为特异产物得到的良好扩增，所以它的峰是最高的（纵坐标，荧光信号强度）。引物二聚体和非特异条带的峰一般比较低。 |
cnb19873楼2011-04-06 19:12:08
4楼2011-04-06 19:21:37
★ ★
amisking(金币+2, EPI+1): 鼓励发帖交流。 2011-04-06 19:46:07
amisking(金币+2, EPI+1): 鼓励发帖交流。 2011-04-06 19:46:07
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差别不大，最关键的是cDNA要做反转录，反转录酶很贵啊……所以一般都用质粒优化。 如果用的是sybr green一类的荧光染料，引物二聚体会影响荧光定量PCR的结果的。sybr green可以非特异地和双链DNA结合，不管是目的产物、引物二聚体还是非特异产物，都可以产生荧光信号，而仪器是不能区分它们的信号的，所以引物二聚体和非特异产物会干扰定量结果。 可以试着提高退火温度，看看能不能减少引物二聚体。有没有二聚体就看融解曲线好了，跑胶的话，看不出是残余的引物还是引物二聚体。 |
5楼2011-04-06 19:32:57
6楼2011-04-06 20:05:57
简单回复
2011-04-06 23:16
回复
nininini(金币+1):谢谢参与
xiaogenv11楼
2011-04-09 09:57
回复
nininini(金币+1):谢谢参与
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