应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 【求助】几个关于实时定量PCR的问题
51/1返回列表
查看: 2847  |  回复: 12
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 BioEPI ，点击这里进行查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

nininini

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助】几个关于实时定量PCR的问题

在PCR条件优化时，以什么为模板呢，含目的片段的质粒？cDNA？还是基因组？还是都可以呢？
熔接曲线能区分引物二聚体和非特异性条带吗？
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2011-04-06 18:46:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

nininini

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-04-06 19:12:08:
质粒比cDNA和基因组DNA更容易获得，所以要优化PCR，可以用质粒作模板。
融解曲线可以区分的。融解曲线的峰会告诉你有多少种产物，峰的位置(横坐标，温度）指示了这些产物各自的熔解温度。假如只有一个峰，就是 ...

谢谢，回复的很详细~~
但是我还是有一些疑问: 质粒为模板优化的条件与以cDNA为模板的扩增条件能保持一致吗？另外，如果是引物二聚体而不是非特异性扩增的话会影响我的实时定量结果吗？
谢谢~~
赞一下 回复此楼
4楼2011-04-06 19:21:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 13 个回答

西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★
nininini(金币+1):谢谢参与
nininini(金币+4): 2011-04-06 19:18:55
引用回帖:
Originally posted by nininini at 2011-04-06 18:46:47:
在PCR条件优化时，以什么为模板呢，含目的片段的质粒？cDNA？还是基因组？还是都可以呢？
熔接曲线能区分引物二聚体和非特异性条带吗？

质粒比cDNA和基因组DNA更容易获得，所以要优化PCR，可以用质粒作模板。
融解曲线可以区分的。融解曲线的峰会告诉你有多少种产物，峰的位置(横坐标，温度）指示了这些产物各自的熔解温度。假如只有一个峰，就是特异产物啦（tm值符合设计引物时分析的结果）。引物二聚体因为片段小，tm值也小，峰会比较靠前。非特异条带则不一定。
因为特异产物得到的良好扩增，所以它的峰是最高的（纵坐标，荧光信号强度）。引物二聚体和非特异条带的峰一般比较低。
赞一下(3人) 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

cnb1987
3楼2011-04-06 19:12:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★ ★
amisking(金币+2, EPI+1): 鼓励发帖交流。 2011-04-06 19:46:07
引用回帖:
Originally posted by nininini at 2011-04-06 19:21:37:
谢谢，回复的很详细~~
但是我还是有一些疑问: 质粒为模板优化的条件与以cDNA为模板的扩增条件能保持一致吗？另外，如果是引物二聚体而不是非特异性扩增的话会影响我的实时定量结果吗？
谢谢~~

差别不大，最关键的是cDNA要做反转录，反转录酶很贵啊……所以一般都用质粒优化。
如果用的是sybr green一类的荧光染料，引物二聚体会影响荧光定量PCR的结果的。sybr green可以非特异地和双链DNA结合，不管是目的产物、引物二聚体还是非特异产物，都可以产生荧光信号，而仪器是不能区分它们的信号的，所以引物二聚体和非特异产物会干扰定量结果。
可以试着提高退火温度，看看能不能减少引物二聚体。有没有二聚体就看融解曲线好了，跑胶的话，看不出是残余的引物还是引物二聚体。
赞一下(1人) 回复此楼
5楼2011-04-06 19:32:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sai00fuji

金虫 (正式写手)
★
nininini(金币+1):谢谢参与
引物设计挺关键的
赞一下(1人) 回复此楼
6楼2011-04-06 20:05:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
简单回复
blackrose80898楼
2011-04-06 23:16   回复  
nininini(金币+1):谢谢参与
引用回帖:
Originally posted by 65900931 at 2011-04-06 23:11:20: 通常不会用质粒去优化。 1. 不是每个基因你都有对应的质粒。 2. 质粒优化产生的PCR条件虽然大多数情况下可以直接用于cDNA或基因组PCR，但是你还需要做具体实验微环境下的标准曲线。reviewer 不会放你过关。意思 ...

xiaogenv11楼
2011-04-09 09:57   回复  
nininini(金币+1):谢谢参与
查看全部 13 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 建议基金发布提前给出明确的时间点 +11 kulium 2026-08-21 14/700 2026-08-24 02:12 by 流流伤
[基金申请] 范进中举一文的中心思想 +4 炎黄贵胄 2026-08-22 5/250 2026-08-24 02:09 by 流流伤
[基金申请] 2026国自然函评费到账 +16 羊腰板 2026-08-21 17/850 2026-08-23 23:02 by tianxiaochun
[基金申请] 让我中一个面上吧！ +12 大萍1987 2026-08-20 15/750 2026-08-23 20:44 by 大萍1987
[基金申请] 今天放榜吗？ +15 布布和一二 2026-08-19 16/800 2026-08-23 09:55 by 张春生
[基金申请] 93BebMhtakh前后11位开头都是大写 +7 且听虎啸 2026-08-17 8/400 2026-08-22 21:55 by 医学老男孩
[基金申请] filecode，4个jtjc了 +13 ziyangfang 2026-08-19 16/800 2026-08-22 17:08 by WH3796
[基金申请] 人气不行了 +8 fansofjerry 2026-08-21 8/400 2026-08-22 16:30 by zyqchem
[基金申请] 今天基金会出结果吗？20260819 +16 kkkl_v 2026-08-19 17/850 2026-08-22 16:12 by 阿布Abu
[基金申请] 时间戳今天，20号变了 +5 archvillain 2026-08-20 5/250 2026-08-22 06:12 by hui_daxiao
[基金申请] 科研孤儿太难了 +17 我4大白菜 2026-08-20 18/900 2026-08-21 20:57 by zhangev
[基金申请] 时间戳又变了 +13 wuchongjun 2026-08-20 19/950 2026-08-21 17:21 by 紫杉醇
[基金申请] 感觉是下周放榜了 +7 angus9576 2026-08-17 12/600 2026-08-21 13:38 by weiyin
[基金申请] 应该是下周三26日公布了吧？ +4 哈哈蛤？ 2026-08-21 4/200 2026-08-21 10:58 by Vivilian
[论文投稿] 投稿咨询 +5 wwm09 2026-08-17 7/350 2026-08-21 10:11 by 期刊论文帮手
[基金申请] 今天放榜没戏了吧 +9 yuleib84 2026-08-19 11/550 2026-08-21 10:06 by gltch
[基金申请] 估计是周四 +3 archvillain 2026-08-18 3/150 2026-08-21 01:48 by jnhyjjm
[基金申请] 时间戳变了，能看出什么问题？ +18 基诺咪客 2026-08-17 23/1150 2026-08-20 17:19 by Godzela
[基金申请] 重要消息，中午系统在维护 +11 yuleib84 2026-08-18 12/600 2026-08-20 11:09 by xskun
[基金申请] 今天维护系统维护 祝所有人 高中 +8 gjjjzhong 2026-08-18 9/450 2026-08-18 13:01 by 家与远方
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭