应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 【求助】几个关于实时定量PCR的问题
131/1返回列表
查看: 2286  |  回复: 12
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 BioEPI ，点击这里进行查看

nininini

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助】几个关于实时定量PCR的问题

在PCR条件优化时，以什么为模板呢，含目的片段的质粒？cDNA？还是基因组？还是都可以呢？
熔接曲线能区分引物二聚体和非特异性条带吗？
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2011-04-06 18:46:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

65900931

银虫 (小有名气)
★
nininini(金币+1):谢谢参与
nininini(金币+6): 2011-04-07 10:36:07
通常不会用质粒去优化。
1. 不是每个基因你都有对应的质粒。
2. 质粒优化产生的PCR条件虽然大多数情况下可以直接用于cDNA或基因组PCR，但是你还需要做具体实验微环境下的标准曲线。reviewer 不会放你过关。意思就是你优化完了条件，还要用cDNA或genomic做一次标准曲线，看看扩增效率和线性范围是否达到要求。
3. 纯质粒很难产生非特异性扩增，你不能检测引物特异性。无法保证实验中不会产生非特异性扩增，如果有了非特异性扩增，你必须改变条件，条件变了，又要重新优化。
4. 逆转录价格并不贵。通常都是一次性反转录大量cDNA，然后酒精沉淀纯化，分装冻存，用于制作标准曲线和条件优化。一次正交设计就能解决问题。
5. 质粒需线性化才能达到理想扩增效果。
赞一下(2人) 回复此楼
7楼2011-04-06 23:11:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

qiyepeng

禁虫 (著名写手)
★
nininini(金币+1):谢谢参与
本帖内容被屏蔽
2楼2011-04-06 18:53:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★
nininini(金币+1):谢谢参与
nininini(金币+4): 2011-04-06 19:18:55
引用回帖:
Originally posted by nininini at 2011-04-06 18:46:47:
在PCR条件优化时，以什么为模板呢，含目的片段的质粒？cDNA？还是基因组？还是都可以呢？
熔接曲线能区分引物二聚体和非特异性条带吗？

质粒比cDNA和基因组DNA更容易获得，所以要优化PCR，可以用质粒作模板。
融解曲线可以区分的。融解曲线的峰会告诉你有多少种产物，峰的位置(横坐标，温度）指示了这些产物各自的熔解温度。假如只有一个峰，就是特异产物啦（tm值符合设计引物时分析的结果）。引物二聚体因为片段小，tm值也小，峰会比较靠前。非特异条带则不一定。
因为特异产物得到的良好扩增，所以它的峰是最高的（纵坐标，荧光信号强度）。引物二聚体和非特异条带的峰一般比较低。
赞一下(3人) 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

cnb1987
3楼2011-04-06 19:12:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

nininini

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-04-06 19:12:08:
质粒比cDNA和基因组DNA更容易获得，所以要优化PCR，可以用质粒作模板。
融解曲线可以区分的。融解曲线的峰会告诉你有多少种产物，峰的位置(横坐标，温度）指示了这些产物各自的熔解温度。假如只有一个峰，就是 ...

谢谢，回复的很详细~~
但是我还是有一些疑问: 质粒为模板优化的条件与以cDNA为模板的扩增条件能保持一致吗？另外，如果是引物二聚体而不是非特异性扩增的话会影响我的实时定量结果吗？
谢谢~~
赞一下 回复此楼
4楼2011-04-06 19:21:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★ ★
amisking(金币+2, EPI+1): 鼓励发帖交流。 2011-04-06 19:46:07
引用回帖:
Originally posted by nininini at 2011-04-06 19:21:37:
谢谢，回复的很详细~~
但是我还是有一些疑问: 质粒为模板优化的条件与以cDNA为模板的扩增条件能保持一致吗？另外，如果是引物二聚体而不是非特异性扩增的话会影响我的实时定量结果吗？
谢谢~~

差别不大，最关键的是cDNA要做反转录，反转录酶很贵啊……所以一般都用质粒优化。
如果用的是sybr green一类的荧光染料，引物二聚体会影响荧光定量PCR的结果的。sybr green可以非特异地和双链DNA结合，不管是目的产物、引物二聚体还是非特异产物，都可以产生荧光信号，而仪器是不能区分它们的信号的，所以引物二聚体和非特异产物会干扰定量结果。
可以试着提高退火温度，看看能不能减少引物二聚体。有没有二聚体就看融解曲线好了，跑胶的话，看不出是残余的引物还是引物二聚体。
赞一下(1人) 回复此楼
5楼2011-04-06 19:32:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sai00fuji

金虫 (正式写手)
★
nininini(金币+1):谢谢参与
引物设计挺关键的
赞一下(1人) 回复此楼
6楼2011-04-06 20:05:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

辛雨237

铁杆木虫 (著名写手)
★
nininini(金币+1):谢谢参与
????
回复此楼
9楼2011-04-09 08:58:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cnb1987

银虫 (小有名气)
★
nininini(金币+1): 谢谢参与
送鲜花一朵
引用回帖:
368790楼: Originally posted by 西瓜 at 2011-04-06 19:12:08
质粒比cDNA和基因组DNA更容易获得，所以要优化PCR，可以用质粒作模板。
融解曲线可以区分的。融解曲线的峰会告诉你有多少种产物，峰的位置(横坐标，温度）指示了这些产物各自的熔解温度。假如只有一个峰，就是特异 ...

西瓜，再问你一下，荧光定量用基因组DNA为模板，可以扩出目的基因么？不是夸内含子，扩出来的目的基因岂不是很大，条件优化是不是用基因组DNA 就可以扩出，含有内含子的序列？
赞一下 回复此楼
12楼2012-07-07 20:25:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

哎呀那个雨

铜虫 (初入文坛)
★
nininini(金币+1): 谢谢参与
引用回帖:
7楼: Originally posted by 65900931 at 2011-04-06 23:11:20
通常不会用质粒去优化。
1. 不是每个基因你都有对应的质粒。
2. 质粒优化产生的PCR条件虽然大多数情况下可以直接用于cDNA或基因组PCR，但是你还需要做具体实验微环境下的标准曲线。reviewer 不会放你过关。意思就 ...

请问质粒作为模板时要线性化吗
赞一下 回复此楼
13楼2015-07-07 19:37:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
简单回复
blackrose80898楼
2011-04-06 23:16   回复  
nininini(金币+1):谢谢参与
引用回帖:
Originally posted by 65900931 at 2011-04-06 23:11:20: 通常不会用质粒去优化。 1. 不是每个基因你都有对应的质粒。 2. 质粒优化产生的PCR条件虽然大多数情况下可以直接用于cDNA或基因组PCR，但是你还需要做具体实验微环境下的标准曲线。reviewer 不会放你过关。意思 ...

200915510楼
2011-04-09 09:42   回复  
nininini(金币+1):谢谢参与
xiaogenv11楼
2011-04-09 09:57   回复  
nininini(金币+1):谢谢参与
相关版块跳转 我要订阅楼主 nininini 的主题更新
131/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭