| 查看: 237 | 回复: 2 | |||
lhm_hnyj金虫 (小有名气)
|
[交流]
【求助/交流】100bp左右SYBR Green I实时荧光？可能吗？ 已有2人参与
|
最近有家单位报送材料让进行实验复核，其中有用到SYBR Green I实时荧光对100bp左右目的片段定性检测，抛开引物特异性不说，引物二聚体都很有可能对目的片段造成干扰吧。初试了一下，结果稀里哗啦，阴性Tm75°，阳性77°；Ct值阴性31，阳性出现三个值，13.7,15.9,22.很是崩溃。这影响因素可太多了，一条一条排除可是有得折腾了，关键是不知道中不值得这么费劲，这么小片段用这样的方法来定性可行吗？麻烦大家给支支招 |
回复此楼» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有178人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
-
留学--博士招生
已经有16人回复
-
化学工程，本211，求调剂，ab区不限
已经有4人回复
-
湖北师范大学招调剂啦
已经有6人回复
-
邵阳学院食品与化学工程学院硕士调剂
已经有0人回复
-
天津商业大学 生物与医药课题组招生
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- SYBR Green I染料法real time qPCR熔解曲线的问题
已经有4人回复
- 请问我全长基因跑出来之后为什么要小100bp左右呢？
已经有9人回复
- 关于SYBR Green I的问题
已经有4人回复
- 单链DNA大小为100np,PCR后跑电泳，条带在200bp左右是怎么回事？求助！！
已经有4人回复
- 做DGGE所用取代EB的荧光染料应为SYBR Green 1 还是SYBR Green 2
已经有11人回复
- 请教PCR高手，使用SYBR Green I法进行荧光定量PCR对于产物大小有什么要求？
已经有21人回复
西瓜
荣誉版主 (知名作家)
- MolEPI: 50
- 应助: 94 (初中生)
- 贵宾: 3.157
- 金币: 1849.6
- 散金: 11458
- 红花: 116
- 沙发: 21
- 帖子: 7553
- 在线: 1449.5小时
- 虫号: 271749
- 注册: 2006-08-13
- 性别: GG
- 专业: 细胞衰老
- 管辖: 分子生物
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+6): good 2011-04-01 19:52:38
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+6): good 2011-04-01 19:52:38
|
对楼主稀里哗啦的结果没看明白--！ But, 100 bp的片段用来做荧光定量PCR是比较合适的大小哦。片段太长，PCR体系消耗很快，酶活力、引物、dNTP这些东东只要有一个不足，PCR反应就不满足2的N次方的公式了，这样定量就不准确了。 短的片段，容易实现有效扩增，定量更准确，实验的一致性也更好，而且片段短了，延伸时间也短，可以缩短整个PCR的时间。 天根的培训资料提到，荧光定量PCR的扩增片段最好在100-150 bp，最长不超过400 bp。TaKaRa的试剂盒说明书里说，扩增片段最好在80-150 bp，最长不超过300 bp。我见过的，一般用 150=200 bp。 荧光定量PCR对引物的设计要求是比较高的，引物二聚体的问题，一般在设计引物时就考虑到了，会尽量避免选用容易形成二聚体的引物。 如果楼主是刚开始做，我觉得加样造成误差的可能性比较大哦。你可以试试同样的东西做3管，看看自己操作的一致性如何。 |
2楼2011-04-01 10:43:43
lhm_hnyj
金虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 156.3
- 散金: 29
- 帖子: 292
- 在线: 166.6小时
- 虫号: 801682
- 注册: 2009-07-01
- 性别: MM
- 专业: 中药检定
3楼2011-04-01 13:44:30
