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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】100bp左右SYBR Green I实时荧光？可能吗？
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lhm_hnyj

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】100bp左右SYBR Green I实时荧光？可能吗？ 已有2人参与

最近有家单位报送材料让进行实验复核，其中有用到SYBR Green I实时荧光对100bp左右目的片段定性检测，抛开引物特异性不说，引物二聚体都很有可能对目的片段造成干扰吧。初试了一下，结果稀里哗啦，阴性Tm75°，阳性77°；Ct值阴性31，阳性出现三个值，13.7,15.9,22.很是崩溃。这影响因素可太多了，一条一条排除可是有得折腾了，关键是不知道中不值得这么费劲，这么小片段用这样的方法来定性可行吗？麻烦大家给支支招
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1楼 2011-04-01 09:50:17
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+6): good 2011-04-01 19:52:38
对楼主稀里哗啦的结果没看明白--！

But, 100 bp的片段用来做荧光定量PCR是比较合适的大小哦。片段太长，PCR体系消耗很快，酶活力、引物、dNTP这些东东只要有一个不足，PCR反应就不满足2的N次方的公式了，这样定量就不准确了。
短的片段，容易实现有效扩增，定量更准确，实验的一致性也更好，而且片段短了，延伸时间也短，可以缩短整个PCR的时间。
天根的培训资料提到，荧光定量PCR的扩增片段最好在100-150 bp，最长不超过400 bp。TaKaRa的试剂盒说明书里说，扩增片段最好在80-150 bp，最长不超过300 bp。我见过的，一般用 150=200 bp。

荧光定量PCR对引物的设计要求是比较高的，引物二聚体的问题，一般在设计引物时就考虑到了，会尽量避免选用容易形成二聚体的引物。

如果楼主是刚开始做，我觉得加样造成误差的可能性比较大哦。你可以试试同样的东西做3管，看看自己操作的一致性如何。
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2楼2011-04-01 10:43:43
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lhm_hnyj

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-04-01 10:43:43:
对楼主稀里哗啦的结果没看明白--！

But, 100 bp的片段用来做荧光定量PCR是比较合适的大小哦。片段太长，PCR体系消耗很快，酶活力、引物、dNTP这些东东只要有一个不足，PCR反应就不满足2的N次方的公式了，这样定 ...

不好意思，确实是才开始做，而且接触分子的时间也不长，所以算得上是还没入门。按照对方资料提供的PCR条件做的，各两份平行样，仪器给出的数据是没法进行结果判定，对了，我们只是进行真伪鉴别，暂时不用定量还相对好点。PCR产物电泳，引物二聚体部分存在，目的条带仅在正品样本中出现，伪品中没有，显示扩增结果正常。
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3楼2011-04-01 13:44:30
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