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[交流]
【求助/交流】原生质体培养
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| 请问有没有做过原生质体培养的啊，能不能麻烦有经验的虫友分享一下原生质体的分离，纯化和培养等相关的知识啊？谢谢！ |
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3楼2011-03-27 17:40:43
2楼2011-03-26 22:14:42
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BY2细胞原生质体检测细胞定位 （1） By-2悬浮细胞的培养及保存 液体培养基：（1L） 800ml ddH2O 4.3g MS salt 200mg KH2PO4 30g Sucrose 以KOH调节 pH至5.8，定容至1L，113度，30分钟灭菌。 使用前加入 100mg Inositol（肌醇） 1mg Thiamin（VB1）硫胺 2mg Glycine（氨基乙酸） 以上三种一般配置成1000乘的贮存液，过滤后灭菌保存于-20度。 0.6mg 2-4-D（以无水乙醇配置10mg/ml，每100ml BY2液体培养基加入6ul）。加入以上物质后的BY2液体培养基放4度保存，不加上述物质可以放于常温。 注：以上为液体培养基，固体培养基则加入1%的琼脂。 培养的悬浮细胞，以1:20-1:25转接至液体培养基中，135rpm，26度暗培养，4-7天转接一次，长期不用则在固体培养基中，26度暗培养，倒置平板，一个月转接一次，使用前在液体培养基中活化2-3天。 （2） By2原生质体的制备 酶液（10ml） 2% Cellulase R-10（0.2g） 0.2% Macerozyme R-10（0.02g） 0.2% BSA（0.02g） 0.36ul/ml β-mercaptoethanol（3.6ul） 5mM MES（pH5.8） 0.4M Mannitol（5ml体积的0.8M的Mannitol） 1mM CaCl2（100ul体积的0.1M的CaCl2） 1）先于带刻度的15ml的试管中，称量固体，于超净台加入MES，mannitol，CaCl2，加ddH2O定容至10ml，摇匀，在于通风橱加入β-mercaptoethanol。 2）悬浮的细胞转接后3-4天，加入于50ml离心管中，1000rpm离心2分钟，小心地吸弃上清，以漂洗液（0.4M的Mannitol，5mM的MES（pH5.8））小心地漂洗一次，即颠倒混匀离心即可，万勿剧烈震荡，600-800rpm离心2分钟，吸弃上清，加入裂解酶液，轻轻摇匀，转移至干净的小烧杯中。小烧杯以封口膜封住，再以黑塑料袋包住避光，于摇床上40rpm消化3-4小时。 3）通过显微镜观察消化的程度，可以后酶解液以40um的Nylon mesh过滤，即用一漏斗与Nylon mesh过滤至10ml的管子中，800rpm离心3分钟。 4）将原生质体以漂洗液（0.4M的Mannitol，5mM的MES（pH5.8））洗1-2遍，再以电转液（0.4M的Mannitol，5mM的MES（pH5.8）），70mM的KCl）洗1-2次，离心速度都为700-800rpm，时间约为3分钟。加溶液时小心地加入，不要用力过猛。最后悬浮于0.5ml的电转液中，通过血细胞计数器在显微镜下估测浓度，通过加电转液稀释至浓度为2×106个细胞/ml，放置冰上保存备用。 5）清洗2mm的电转杯，自来水洗两遍，ddH2O洗两遍，倒置于吸水纸上，在空的EP管上标号，每管加入400ul原生质体细胞、2ul鲑鱼精DNA、10-20ug质粒（注：质粒必须大提，然后浓缩至1ug/1ul以上），小心地混匀转入2mm的电击杯中（电击杯预先冰浴）。 6）擦净电击杯的水，进行电击，参数如下：电压：150LV，电阻：50Ω，电容：900uF（电击的输出参数约为140V，14ms；细胞的存活率为40%，转化效率约为50%）。 7）电击结束后，向电击杯小心地加入1ml的电转液，轻轻地吹打，将细胞吹打出来，可见部分死细胞，转移至EP管中，冰浴30分钟，4度，900rpm离心2分钟，收集细胞。 8）于六孔板加入5%的小牛血清，请摇晃几秒进行封闭，倒出于每孔加入2ml的原生质体培养液（可以含适当的抗生素，抑制细菌）。 9）上接第7步，吸弃上清后，加入1ml的原生质体培养液，用移液器轻轻吹匀，转移至六孔板中，摇匀，盖上盖子并标记好顺序，用报纸包住放于26度静置培养（GFP为16小时，Gus assay则为24小时）。 10)16度静置暗培养后，转移至EP管中，1000rpm离心2分钟，吸弃上清，留100ul左右，轻轻摇匀，可于显微镜下观察。 注：可以用线粒体燃料，DAPI（以ddH2O溶解成Stock solution（1-5mg/ml）,保存于-20度，用时1:1000稀释即可）等染细胞，30分钟后以原生体培养液洗1次即可。 原生质体培养液（浓度关系）：使用时加入MES 0.5× MS salt 液体培养基 0.4M Mannitol 3% Sucrose 5mM MES（pH5.8） |
4楼2011-03-27 20:42:41
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拟南芥原生质体的分离与转染 1）以4周龄未抽苔的、生长状态良好的野生型拟南芥，取5-7 片真叶，以刀片 将叶片中间部分切成0.5-1mm 的叶条，将叶条放入10ml 酶解液（20mM MES （PH5.7），1.5%（W/V）纤维素酶R-10，0.4%（W/V）离析酶R-10，0.4M 甘 露醇，20mM KCl，55℃温浴10 分钟灭活DNase，加入终浓度为10mM CaCl2， 0.1% BSA，2mM 巯基乙醇，最后以0.45um 的滤头过滤备用）。 2） 在真空干燥器中，黑暗条件下抽真空30 分钟，然后于黑暗条件下静置消化3 小时以上，轻摇后应看到条形的叶片几乎消失，此时可在显微镜下观察原生质体的释放情况。 3）以等体积的W5 溶液（2mM MES(PH5.7)，154mM NaCl，125mM CaCl2, 5mM KCl）稀释酶解消化液，以75um 的尼龙膜过滤，将滤液于室温条件下100g 离心2 分钟，吸弃上清，以少量W5 溶液重悬原生质体。 4）在显微镜下以血细胞计数器计数原生质体细胞，最后以W5 溶液将原生质体溶液悬浮至浓度为2×105ml-1。放置于冰上冰浴30 分钟，然后尽可能用移液器移除W5 溶液。 5）以室温保存的MMG 溶液（4mM MES(PH5.7)，0.4M 甘露醇，15mM MgCl2）将原生质体悬浮至浓度为2×105/ml。 6）于2ml 的EP 管中加入10ulDNA（浓度必须达到1ug/ul），加入100ul 原生质 体细胞（2×104ml-1），轻轻混匀，加入110ul 现配现用的PEG 溶液（40% PEG4000， 0.2M 甘露醇，0.1M CaCl2）并轻弹EP 管将其混匀，室温放置10 分钟，缓慢加 入440ul 的W5 溶液稀释反应液，轻轻颠倒混匀，100g 离心2 分钟，小心地吸弃上清。 7）加入1ml 的WI 溶液（4mM MES(PH5.7)，0.4M 甘露醇，15mM MgCl2） 轻悬原生质体细胞，转移至六孔板中（预先以5%小牛血清处理5 秒钟），黑暗条件下室温培养12-16 小时。 8）100g 离心2 分钟，去除上清（留100-200ul 即可），以DAPI 染色细胞核，制片于荧光显微镜下观察。采用冷CCD 进行照相，原生质的形状在可见光下进行观察。 注：CaCl2是过滤灭菌，操作过程要小心，不可用力过猛，将移液器枪头切去一点。 |
5楼2011-03-27 20:43:13
