| 查看: 3324 | 回复: 15 | |||
| 【有奖交流】积极回复本帖子，参与交流，就有机会分得作者 huang1030 的 9 个金币 ，回帖就立即获得 1 个金币，每人有 1 次机会 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
[交流]
【求助/交流】原生质体培养
|
|||
| 请问有没有做过原生质体培养的啊，能不能麻烦有经验的虫友分享一下原生质体的分离，纯化和培养等相关的知识啊？谢谢！ |
回复此楼» 本帖已获得的红花（最新10朵）
liuxq1982» 猜你喜欢
甲酰肼和三苯基膦
已经有0人回复
-
加拿大工签时间
已经有5人回复
-
植物学论文润色/翻译怎么收费?
已经有154人回复
-
是不是要被拒稿了啊？
已经有14人回复
-
渣硕怎么考个在职博士啊。现在在职。
已经有10人回复
-
有没有招定向的博士的呀。。
已经有2人回复
-
省基金申请为什么要限制名额。
已经有17人回复
-
各位老铁来说说怎么才能写好国自然面上的标书。
已经有6人回复
-
基金委系统在研项目
已经有6人回复
-
297生物学求调剂
已经有12人回复
-
求调剂求调剂
已经有1人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 求助做黑曲霉原生质的问题
已经有15人回复
- 关于原生质体单核化
已经有5人回复
- 拟南芥 原生质体
已经有4人回复
- 植物细胞悬浮培养能否绕过愈伤发生？
已经有5人回复
- 真菌及其原生质体的拍照问题
已经有4人回复
- 原生质体单核化问题 急求！！！！！
已经有3人回复
- 【求助】被孢霉原生质体制备
已经有9人回复
- 【求助/交流】请问下大家什么是R2培养基
已经有10人回复
» 抢金币啦！回帖就可以得到:
-
坐标川渝，非诚勿扰
+1/254
-
征男友（呼和浩特）
+1/216
-
119VS911
+5/206
-
中国科学院上海高等研究院-长期招收催化与材料方向博士后
+1/148
-
深圳技术大学未来技术学院刘清侠院士课题组招聘科研助理
+2/48
-
放弃武汉大学组建实验室的机会！
+1/36
-
【管科博士招生】大连理工大学于洋老师招博士
+1/34
-
重庆大学-电子皮肤研究方向博士研究生招生
+1/31
-
山东大学集成电路学院柔性电子方向博士后招聘
+1/16
-
伦敦大学学院（UCL）手术机器人方向2025/26博士奖学金（机械/自动化/电子/生医工程）
+1/10
-
澳门理工大学2025博士招生，AI for Biomedicine and Healthcare方向
+1/8
-
中国科学院西北生态环境资源研究院畜牧学课题组科研助理招聘启事
+1/7
-
硅碳软包电极拆解
+1/6
-
英国莱斯特大学-化学学院-招收CSC博士生
+1/6
-
济南大学化学化工学院国家级人才团队招聘信息
+1/5
-
质子交换膜电解水仿真
+1/4
-
俄亥俄大学化学与生物化学系 招收全奖博士研究生
+1/3
-
车载以太网PHY芯片原理与解码流程
+1/2
-
重点大学--世界双一流学科--国家优青--招“申请-审核”制博士生
+1/2
-
东方理工阮佳伟课题组招博士-香港理工大学学位
+1/1
+1/254
|
拟南芥原生质体的分离与转染 1）以4周龄未抽苔的、生长状态良好的野生型拟南芥，取5-7 片真叶，以刀片 将叶片中间部分切成0.5-1mm 的叶条，将叶条放入10ml 酶解液（20mM MES （PH5.7），1.5%（W/V）纤维素酶R-10，0.4%（W/V）离析酶R-10，0.4M 甘 露醇，20mM KCl，55℃温浴10 分钟灭活DNase，加入终浓度为10mM CaCl2， 0.1% BSA，2mM 巯基乙醇，最后以0.45um 的滤头过滤备用）。 2） 在真空干燥器中，黑暗条件下抽真空30 分钟，然后于黑暗条件下静置消化3 小时以上，轻摇后应看到条形的叶片几乎消失，此时可在显微镜下观察原生质体的释放情况。 3）以等体积的W5 溶液（2mM MES(PH5.7)，154mM NaCl，125mM CaCl2, 5mM KCl）稀释酶解消化液，以75um 的尼龙膜过滤，将滤液于室温条件下100g 离心2 分钟，吸弃上清，以少量W5 溶液重悬原生质体。 4）在显微镜下以血细胞计数器计数原生质体细胞，最后以W5 溶液将原生质体溶液悬浮至浓度为2×105ml-1。放置于冰上冰浴30 分钟，然后尽可能用移液器移除W5 溶液。 5）以室温保存的MMG 溶液（4mM MES(PH5.7)，0.4M 甘露醇，15mM MgCl2）将原生质体悬浮至浓度为2×105/ml。 6）于2ml 的EP 管中加入10ulDNA（浓度必须达到1ug/ul），加入100ul 原生质 体细胞（2×104ml-1），轻轻混匀，加入110ul 现配现用的PEG 溶液（40% PEG4000， 0.2M 甘露醇，0.1M CaCl2）并轻弹EP 管将其混匀，室温放置10 分钟，缓慢加 入440ul 的W5 溶液稀释反应液，轻轻颠倒混匀，100g 离心2 分钟，小心地吸弃上清。 7）加入1ml 的WI 溶液（4mM MES(PH5.7)，0.4M 甘露醇，15mM MgCl2） 轻悬原生质体细胞，转移至六孔板中（预先以5%小牛血清处理5 秒钟），黑暗条件下室温培养12-16 小时。 8）100g 离心2 分钟，去除上清（留100-200ul 即可），以DAPI 染色细胞核，制片于荧光显微镜下观察。采用冷CCD 进行照相，原生质的形状在可见光下进行观察。 注：CaCl2是过滤灭菌，操作过程要小心，不可用力过猛，将移液器枪头切去一点。 |
5楼2011-03-27 20:43:13
2楼2011-03-26 22:14:42
3楼2011-03-27 17:40:43
|
BY2细胞原生质体检测细胞定位 （1） By-2悬浮细胞的培养及保存 液体培养基：（1L） 800ml ddH2O 4.3g MS salt 200mg KH2PO4 30g Sucrose 以KOH调节 pH至5.8，定容至1L，113度，30分钟灭菌。 使用前加入 100mg Inositol（肌醇） 1mg Thiamin（VB1）硫胺 2mg Glycine（氨基乙酸） 以上三种一般配置成1000乘的贮存液，过滤后灭菌保存于-20度。 0.6mg 2-4-D（以无水乙醇配置10mg/ml，每100ml BY2液体培养基加入6ul）。加入以上物质后的BY2液体培养基放4度保存，不加上述物质可以放于常温。 注：以上为液体培养基，固体培养基则加入1%的琼脂。 培养的悬浮细胞，以1:20-1:25转接至液体培养基中，135rpm，26度暗培养，4-7天转接一次，长期不用则在固体培养基中，26度暗培养，倒置平板，一个月转接一次，使用前在液体培养基中活化2-3天。 （2） By2原生质体的制备 酶液（10ml） 2% Cellulase R-10（0.2g） 0.2% Macerozyme R-10（0.02g） 0.2% BSA（0.02g） 0.36ul/ml β-mercaptoethanol（3.6ul） 5mM MES（pH5.8） 0.4M Mannitol（5ml体积的0.8M的Mannitol） 1mM CaCl2（100ul体积的0.1M的CaCl2） 1）先于带刻度的15ml的试管中，称量固体，于超净台加入MES，mannitol，CaCl2，加ddH2O定容至10ml，摇匀，在于通风橱加入β-mercaptoethanol。 2）悬浮的细胞转接后3-4天，加入于50ml离心管中，1000rpm离心2分钟，小心地吸弃上清，以漂洗液（0.4M的Mannitol，5mM的MES（pH5.8））小心地漂洗一次，即颠倒混匀离心即可，万勿剧烈震荡，600-800rpm离心2分钟，吸弃上清，加入裂解酶液，轻轻摇匀，转移至干净的小烧杯中。小烧杯以封口膜封住，再以黑塑料袋包住避光，于摇床上40rpm消化3-4小时。 3）通过显微镜观察消化的程度，可以后酶解液以40um的Nylon mesh过滤，即用一漏斗与Nylon mesh过滤至10ml的管子中，800rpm离心3分钟。 4）将原生质体以漂洗液（0.4M的Mannitol，5mM的MES（pH5.8））洗1-2遍，再以电转液（0.4M的Mannitol，5mM的MES（pH5.8）），70mM的KCl）洗1-2次，离心速度都为700-800rpm，时间约为3分钟。加溶液时小心地加入，不要用力过猛。最后悬浮于0.5ml的电转液中，通过血细胞计数器在显微镜下估测浓度，通过加电转液稀释至浓度为2×106个细胞/ml，放置冰上保存备用。 5）清洗2mm的电转杯，自来水洗两遍，ddH2O洗两遍，倒置于吸水纸上，在空的EP管上标号，每管加入400ul原生质体细胞、2ul鲑鱼精DNA、10-20ug质粒（注：质粒必须大提，然后浓缩至1ug/1ul以上），小心地混匀转入2mm的电击杯中（电击杯预先冰浴）。 6）擦净电击杯的水，进行电击，参数如下：电压：150LV，电阻：50Ω，电容：900uF（电击的输出参数约为140V，14ms；细胞的存活率为40%，转化效率约为50%）。 7）电击结束后，向电击杯小心地加入1ml的电转液，轻轻地吹打，将细胞吹打出来，可见部分死细胞，转移至EP管中，冰浴30分钟，4度，900rpm离心2分钟，收集细胞。 8）于六孔板加入5%的小牛血清，请摇晃几秒进行封闭，倒出于每孔加入2ml的原生质体培养液（可以含适当的抗生素，抑制细菌）。 9）上接第7步，吸弃上清后，加入1ml的原生质体培养液，用移液器轻轻吹匀，转移至六孔板中，摇匀，盖上盖子并标记好顺序，用报纸包住放于26度静置培养（GFP为16小时，Gus assay则为24小时）。 10)16度静置暗培养后，转移至EP管中，1000rpm离心2分钟，吸弃上清，留100ul左右，轻轻摇匀，可于显微镜下观察。 注：可以用线粒体燃料，DAPI（以ddH2O溶解成Stock solution（1-5mg/ml）,保存于-20度，用时1:1000稀释即可）等染细胞，30分钟后以原生体培养液洗1次即可。 原生质体培养液（浓度关系）：使用时加入MES 0.5× MS salt 液体培养基 0.4M Mannitol 3% Sucrose 5mM MES（pH5.8） |
4楼2011-03-27 20:42:41
