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生兴生物

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[交流] 【求助/交流】你知道这些蛋白表达的问题吗？已有3人参与

蛋白表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。越来越多的基因被发现，其中多数基因功能不明，利用蛋白表达系统表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。常见的蛋白表达系统包括大肠杆菌/原核蛋白表达系统、酵母/真核蛋白表达系统、哺乳动物细胞蛋白表达系统、昆虫细胞蛋白表达系统、植物蛋白表达系统。
在此针对一些常见的问题进行总结，与大家共享，共同学习。
Q1：为什么蛋白表达出来了，SDS-PAGE检测时大小不符？A1：进行SDS-PAGE检测的时候蛋白的净电荷会影响迁移率。带电量高的蛋白会结合较少的SDS，因此阻碍了蛋白的泳动。富含脯氨酸的蛋白会在SDS-PAGE胶中移动得特别慢。但是如果蛋白的等电点在5-9之间，并且组成的氨基酸组分没有明显的偏好，那么目的蛋白迁移率与预期相差较远就很有可能不是由于凝胶电泳造成的。
这个时候最好利用C-端或者N-端的标签进行Western Blot，看是否由于蛋白被蛋白酶降解而导致多条目的条带或者比预期小很多的条带出现。如果蛋白酶过高可以尝试换个缺陷菌株。
Q2：如何得到可溶的蛋白？
A2：如果希望得到能行使功能的蛋白，蛋白应该以可溶形式表达。避免包涵体形成的方法很多，比如：选用表达量不高的蛋白表达系统，选择有助于可溶性表达的融合蛋白表达系统等，使用基本培养基等也有助于可溶性表达。另外一个容易忽视的问题是大肠杆菌内还原性过高会导致二硫键不能正确形成，同样容易导致表达产物不溶，更换菌株有助于解决这个问题。
Q3：大肠杆菌蛋白表达实验中需要注意的事项？
A3：（1）所有操作尽量在冰上操作，以避免蛋白质发生变性；
（2）根据自己的需要选择不同的表达载体，并注意不同的表达载体上的融合标签和携带的抗性基因，其中有些标签是可以去除的。
（3）构建好的载体最好进行测序验证，保证读码框正确，即没有移码。
（4）长期保存的pET重组子在高浓度甘油中会导致质粒不稳定。
（5）37 ℃生长常常会使一些蛋白累积形成包涵体，而30 ℃生长则可能产生可溶的和有活性的蛋白。在某些情况下，低温（15－20℃）延长诱导时间可以使溶解性蛋白的产量达到最大。
（6）进行SDS-PAGE分析时，需优化电泳上样体积。
Q4：毕赤酵母系统具有哪些优点？
A4：（1）含有特有的强有力的启动子，这是目前最强、调控机理最严格的启动子之一，用甲醇可严格地调控外源基因的表达；
2）表达水平高，既可在胞内表达，又可分泌型表达。毕赤酵母中，报道的最高表达量为破伤风毒素C为12 g/L，一般大于1 g/L。一般毕赤酵母中外源基因都带有指导分泌的信号肽序列，使表达的外源目的蛋白分泌到发酵液中，有利于分离纯化；
（3）发酵工艺成熟，易放大。已经有大规模工业化高密度生产的发酵工艺，且细胞干重达100 g/L以上，表达重组蛋白时，已成功放大到10000 L；
（4）培养成本低，产物易分离。毕赤酵母所用发酵培养基十分廉价，一般碳源为甘油或葡萄糖及甲醇，其余为无机盐，培养基中不含蛋白，有利于下游产品分离纯化；
（5）外源蛋白基因遗传稳定。一般外源蛋白基因整合到毕赤酵母染色体上，随染色体复制而复制，不易丢失；
（6）作为真核表达系统，毕赤酵母具有真核生物的亚细胞结构，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能。
Q5：一个理想的可诱导蛋白表达系统需要符合哪几个方面的要求？
A5：（1）特异性：该系统不受其他内源因素的影响，仅能被外源的非毒性药物所活化。
（2）非干扰性：该系统成分不能对细胞通路有干扰。
（3）可诱导性：该系统在非活化状态下本底活性最低，而在活化状态下能快速产生高水平的基因表达。
（4）诱导剂的生物利用率：调节分子能快速渗透人各组织，能通过胎盘屏障及血脑屏障。
（5）可逆性：诱导剂能快速被各组织清除使该系统很快恢复非活化状态。
（6）剂量依赖性：该系统的反应与诱导剂的浓度成正比，以便进行定性定量分析。
Q11 蛋白表达实验用到的产品？
A6：试剂：质粒小量提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、PCR产物纯化回收试剂盒、IPTG、琼脂糖、TE缓冲液、氧化型谷胱甘肽、还原型谷胱甘肽、Triton X-100、DTT、PMSF等。服务：Western blot技术服务、ORF克隆技术服务。

[ Last edited by 生兴生物 on 2011-3-23 at 08:06 ]

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