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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】有使用过λDE3溶源化试剂盒的进来看看...
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nestzhao

木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】有使用过λDE3溶源化试剂盒的进来看看...

有没有人用过λDE3 lysogenization kit制备过溶源化菌的

求教一下，需要注意点什么啊

做了几次一直没有成功

很郁闷
.....
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1楼 2011-03-15 09:53:18
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susizheng

木虫 (著名写手)
★ ★
nestzhao(金币+1): 2011-03-15 17:43:18
rainwander(金币+2): 鼓励积极参与交流~~~ 2011-03-15 23:37:03
由于几种Lysate的使用量都很少，建议先取大一点的体积混匀后，再取要使用的量。
没成功是个什么情况？是全部出现噬菌斑了，还是都没出现噬菌斑。
建议还是买公司的溶原菌吧，即使成功了，效果也不是很好的。
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2楼2011-03-15 11:02:14
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nestzhao

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2011-03-15 11:02:14:
由于几种Lysate的使用量都很少，建议先取大一点的体积混匀后，再取要使用的量。
没成功是个什么情况？是全部出现噬菌斑了，还是都没出现噬菌斑。
建议还是买公司的溶原菌吧，即使成功了，效果也不是很好的。

首先按照说明书 要求，将目的菌培养到OD600=0.5 ，然后取了按照他要求的浓度做了梯度，涂布及培养后，长出的菌落远大于他所要求的50-200个   
挑单菌落培养后验证，没有出现噬菌斑 ，而且是他提供的阳性对照株也没有出现噬菌斑，而我用实验室原来就有的的BL21（DE3）做的对照出现了噬菌斑

我也不知道原因出在哪儿了
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3楼2011-03-15 17:47:28
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susizheng

木虫 (著名写手)
nestzhao(金币+1): 2011-03-16 09:27:03
引用回帖:
Originally posted by nestzhao at 2011-03-15 17:47:28:
首先按照说明书 要求，将目的菌培养到OD600=0.5 ，然后取了按照他要求的浓度做了梯度，涂布及培养后，长出的菌落远大于他所要求的50-200个   
挑单菌落培养后验证，没有出现噬菌斑 ，而且是他提供的阳性对照株 ...

那你用的是哪个公司的试剂盒，我看看，不是涂布板子的时候就能看到噬菌斑吗？挑单菌落干啥？
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4楼2011-03-15 22:13:14
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nestzhao

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2011-03-15 22:13:14:
那你用的是哪个公司的试剂盒，我看看，不是涂布板子的时候就能看到噬菌斑吗？挑单菌落干啥？

我用的是Novagen公司提供的试剂盒

我按照他的说明，在溶源化这个过程中就是没有看到噬菌斑

我就试着挑了平板上的单菌落进行溶源化验证  也没有出现噬菌斑

所以就很奇怪
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5楼2011-03-16 09:58:09
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susizheng

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
nestzhao(金币+3): 2011-03-16 21:04:26
rainwander(金币+3): 鼓励分享自己的实验经验~不错 2011-03-16 22:38:46
引用回帖:
Originally posted by nestzhao at 2011-03-16 09:58:09:
我用的是Novagen公司提供的试剂盒

我按照他的说明，在溶源化这个过程中就是没有看到噬菌斑

我就试着挑了平板上的单菌落进行溶源化验证  也没有出现噬菌斑

所以就很奇怪

我找了下实验记录，
我的步骤是，OD长到0.5左右后，
3）取1uL菌液与1 uL ƛDE3 phage lysate，3.3 ul helper phage lysate，1 uL selection phage lysate于37 ℃水浴30 min。（由于所取三种裂解液量较少，可事先取一定体积的三种裂解液混匀，使用时取所需的量）
4）加入100 uL的LB培养基稀释后梯度涂布LB平板，37 ℃培养过夜
一般10 uL菌液能长出比较适合的菌落数。菌落长得少打点，你就可以看到未溶原化的菌落出现噬菌斑，溶原化成功的菌落就比较圆滑。


你如果完全按照说明书做，肯定长得密密麻麻，看不到噬菌斑。
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6楼2011-03-16 14:09:00
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nestzhao

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2011-03-16 14:09:00:
我找了下实验记录，
我的步骤是，OD长到0.5左右后，
3）取1uL菌液与1 uL ƛDE3 phage lysate，3.3 ul helper phage lysate，1 uL selection phage lysate于37 ℃水浴30 min。（由于所取三种裂解液量较少， ...

是啊  我就是完全按照说明书做的，都没什么结果，所以很郁闷

谢谢你的指点啊，我再去试试，希望能有好结果

顺便问一下，你这三种lysate的配比是根据什么来的啊
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7楼2011-03-16 21:13:58
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susizheng

木虫 (著名写手)
nestzhao(金币+2): 2011-03-17 08:26:56
引用回帖:
Originally posted by nestzhao at 2011-03-16 21:13:58:
是啊  我就是完全按照说明书做的，都没什么结果，所以很郁闷

谢谢你的指点啊，我再去试试，希望能有好结果

顺便问一下，你这三种lysate的配比是根据什么来的啊

说明书上的那个滴度单位看不大懂，这个量是另外查资料，找的经验值。
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8楼2011-03-16 22:04:32
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nestzhao

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2011-03-16 22:04:32:
说明书上的那个滴度单位看不大懂，这个量是另外查资料，找的经验值。

恩  好的  谢谢了  希望这次能成功
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9楼2011-03-17 08:26:45
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nestzhao

木虫 (小有名气)
rainwander: 引用回复的时候，引用你自己的帖子了？~ 2011-03-26 17:45:23
引用回帖:
Originally posted by nestzhao at 2011-03-17 08:26:45:
恩  好的  谢谢了  希望这次能成功

不好意思再向你请教一下：

我又重新试了下，按照你的方法，我在平板上得到了合适数量的菌落

但是，在下一步进行溶源化鉴定的时候，仍旧没有出现噬菌斑：也就是说明书所说的溶源化后的菌，在加入tester phage  后用双层平板法，在只有LB的平板上出现的噬菌斑较小，在含有IPTG的平板上能够有较大的噬菌斑。但是，我做的情况是，出现的菌落验证时两种平板都没有出现噬菌斑，而试剂盒里面的HMS174(DE3) Positive Control Glycerol Stock，也没有出现噬菌斑，而我们实验室已有的E coli BL21（DE3）在两个平板上出现噬菌斑，描述和说明书一致。

我就是很迷茫。。。。。
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10楼2011-03-25 21:43:23
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nestzhao

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2011-03-16 14:09:00:
我找了下实验记录，
我的步骤是，OD长到0.5左右后，
3）取1uL菌液与1 uL ƛDE3 phage lysate，3.3 ul helper phage lysate，1 uL selection phage lysate于37 ℃水浴30 min。（由于所取三种裂解液量较少， ...

不好意思再向你请教一下：

我又重新试了下，按照你的方法，我在平板上得到了合适数量的菌落

但是，在下一步进行溶源化鉴定的时候，仍旧没有出现噬菌斑：也就是说明书所说的溶源化后的菌，在加入tester phage  后用双层平板法，在只有LB的平板上出现的噬菌斑较小，在含有IPTG的平板上能够有较大的噬菌斑。但是，我做的情况是，出现的菌落验证时两种平板都没有出现噬菌斑，而试剂盒里面的HMS174(DE3) Positive Control Glycerol Stock，也没有出现噬菌斑，而我们实验室已有的E coli BL21（DE3）在两个平板上出现噬菌斑，描述和说明书一致。

我就是很迷茫。。。。。

[ Last edited by nestzhao on 2011-3-26 at 18:48 ]
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11楼2011-03-26 18:46:55
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susizheng

木虫 (著名写手)
nestzhao(金币+1): 2011-03-27 11:52:38
引用回帖:
Originally posted by nestzhao at 2011-03-26 18:46:55:
不好意思再向你请教一下：

我又重新试了下，按照你的方法，我在平板上得到了合适数量的菌落

但是，在下一步进行溶源化鉴定的时候，仍旧没有出现噬菌斑：也就是说明书所说的溶源化后的菌 ...

平板上得到了合适数量的菌落

这些菌落生长到比较大的时候，形态上有差异吗？
我做到这一步，直接挑取未出现噬菌斑的菌落做表达了。没有鉴定。
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12楼2011-03-27 11:21:44
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nestzhao

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2011-03-27 11:21:44:
平板上得到了合适数量的菌落

这些菌落生长到比较大的时候，形态上有差异吗？
我做到这一步，直接挑取未出现噬菌斑的菌落做表达了。没有鉴定。

形态上没发现什么差异
而且关于这一步的噬菌斑，我也没发现
我做了多个不同的梯度，两个中间梯度产生了合适的菌落数量，比他们的前后梯度的菌落数量都要少，所以我以为是得到了溶源化的菌，进行了一些验证
而且，根据说明书，我以为是selection phage lysate能够把非溶原化的菌在水浴侵染过程中，直接裂解掉而不会产生噬菌斑


另外，我还想问一下，有没有方法可以知道，或者说是查到，某一株菌是不是male strain（带 F‘）
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13楼2011-03-27 12:16:32
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susizheng

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★
nestzhao(金币+1): 2011-03-27 15:15:25
rainwander(金币+5): 鼓励交流~~很热心啊 2011-03-27 17:59:31
如果溶原化后涂板，平板上单菌落长大后就可以可以有差别了，溶原成功的菌落平滑，未溶原的菌落有噬菌斑。

另外，我还想问一下，有没有方法可以知道，或者说是查到，某一株菌是不是male strain（带 F‘）
查该菌的基因型。
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14楼2011-03-27 14:20:19
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nestzhao

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2011-03-27 14:20:19:
如果溶原化后涂板，平板上单菌落长大后就可以可以有差别了，溶原成功的菌落平滑，未溶原的菌落有噬菌斑。

另外，我还想问一下，有没有方法可以知道，或者说是查到，某一株菌是不是male strain（带 F‘）
查该 ...

继续去试试，希望这次能有好运，做实验做的纠结死了
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15楼2011-03-27 15:16:25
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nestzhao

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2011-03-27 14:20:19:
如果溶原化后涂板，平板上单菌落长大后就可以可以有差别了，溶原成功的菌落平滑，未溶原的菌落有噬菌斑。

另外，我还想问一下，有没有方法可以知道，或者说是查到，某一株菌是不是male strain（带 F‘）
查该 ...

再问一个，溶源化构建时，多少时间能够看到噬菌斑

多谢了啊
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16楼2011-03-29 08:58:05
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susizheng

木虫 (著名写手)
nestzhao(金币+1): 2011-04-25 22:46:01
引用回帖:
Originally posted by nestzhao at 2011-03-29 08:58:05:
再问一个，溶源化构建时，多少时间能够看到噬菌斑

多谢了啊

尽量让菌落长得比较明显就可以看得见了。菌落直径1-2 mm吧。
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17楼2011-03-29 09:22:13
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山水88

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
680087楼: Originally posted by susizheng at 2011-03-16 14:09:00
我找了下实验记录，
我的步骤是，OD长到0.5左右后，
3）取1uL菌液与1 uL ƛDE3 phage lysate，3.3 ul helper phage lysate，1 uL selection phage lysate于37 ℃水浴30 min。（由于所取三种裂解液量较少，可 ...

大侠好，问下你做验证的时候你是怎么操作的呀，谢谢
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18楼2012-11-08 15:09:02
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小鼹鼠

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
17楼: Originally posted by susizheng at 2011-03-29 09:22:13
尽量让菌落长得比较明显就可以看得见了。菌落直径1-2 mm吧。

您好！请问做溶原化的时候要注意什么操作方面的细节吗？因为实验室基本都是做大肠的，在做溶原化之前和之后超净台需不需要什么额外的处理呢？谢谢！
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19楼2018-01-02 10:54:51
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