应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】有使用过λDE3溶源化试剂盒的进来看看...
191/1返回列表
查看: 3000  |  回复: 18
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

nestzhao

木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】有使用过λDE3溶源化试剂盒的进来看看...

有没有人用过λDE3 lysogenization kit制备过溶源化菌的

求教一下，需要注意点什么啊

做了几次一直没有成功

很郁闷
.....
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

分子生化实验经验积累

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2011-03-15 09:53:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

susizheng

木虫 (著名写手)
★ ★
nestzhao(金币+1): 2011-03-15 17:43:18
rainwander(金币+2): 鼓励积极参与交流~~~ 2011-03-15 23:37:03
由于几种Lysate的使用量都很少，建议先取大一点的体积混匀后，再取要使用的量。
没成功是个什么情况？是全部出现噬菌斑了，还是都没出现噬菌斑。
建议还是买公司的溶原菌吧，即使成功了，效果也不是很好的。
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2011-03-15 11:02:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

nestzhao

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2011-03-15 11:02:14:
由于几种Lysate的使用量都很少，建议先取大一点的体积混匀后，再取要使用的量。
没成功是个什么情况？是全部出现噬菌斑了，还是都没出现噬菌斑。
建议还是买公司的溶原菌吧，即使成功了，效果也不是很好的。

首先按照说明书 要求，将目的菌培养到OD600=0.5 ，然后取了按照他要求的浓度做了梯度，涂布及培养后，长出的菌落远大于他所要求的50-200个   
挑单菌落培养后验证，没有出现噬菌斑 ，而且是他提供的阳性对照株也没有出现噬菌斑，而我用实验室原来就有的的BL21（DE3）做的对照出现了噬菌斑

我也不知道原因出在哪儿了
赞一下 回复此楼
3楼2011-03-15 17:47:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

susizheng

木虫 (著名写手)
nestzhao(金币+1): 2011-03-16 09:27:03
引用回帖:
Originally posted by nestzhao at 2011-03-15 17:47:28:
首先按照说明书 要求，将目的菌培养到OD600=0.5 ，然后取了按照他要求的浓度做了梯度，涂布及培养后，长出的菌落远大于他所要求的50-200个   
挑单菌落培养后验证，没有出现噬菌斑 ，而且是他提供的阳性对照株 ...

那你用的是哪个公司的试剂盒，我看看，不是涂布板子的时候就能看到噬菌斑吗？挑单菌落干啥？
赞一下 回复此楼
4楼2011-03-15 22:13:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

nestzhao

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2011-03-15 22:13:14:
那你用的是哪个公司的试剂盒，我看看，不是涂布板子的时候就能看到噬菌斑吗？挑单菌落干啥？

我用的是Novagen公司提供的试剂盒

我按照他的说明，在溶源化这个过程中就是没有看到噬菌斑

我就试着挑了平板上的单菌落进行溶源化验证  也没有出现噬菌斑

所以就很奇怪
赞一下 回复此楼
5楼2011-03-16 09:58:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

susizheng

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
nestzhao(金币+3): 2011-03-16 21:04:26
rainwander(金币+3): 鼓励分享自己的实验经验~不错 2011-03-16 22:38:46
引用回帖:
Originally posted by nestzhao at 2011-03-16 09:58:09:
我用的是Novagen公司提供的试剂盒

我按照他的说明，在溶源化这个过程中就是没有看到噬菌斑

我就试着挑了平板上的单菌落进行溶源化验证  也没有出现噬菌斑

所以就很奇怪

我找了下实验记录，
我的步骤是，OD长到0.5左右后，
3）取1uL菌液与1 uL ƛDE3 phage lysate，3.3 ul helper phage lysate，1 uL selection phage lysate于37 ℃水浴30 min。（由于所取三种裂解液量较少，可事先取一定体积的三种裂解液混匀，使用时取所需的量）
4）加入100 uL的LB培养基稀释后梯度涂布LB平板，37 ℃培养过夜
一般10 uL菌液能长出比较适合的菌落数。菌落长得少打点，你就可以看到未溶原化的菌落出现噬菌斑，溶原化成功的菌落就比较圆滑。


你如果完全按照说明书做，肯定长得密密麻麻，看不到噬菌斑。
赞一下(1人) 回复此楼
6楼2011-03-16 14:09:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

nestzhao

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2011-03-16 14:09:00:
我找了下实验记录，
我的步骤是，OD长到0.5左右后，
3）取1uL菌液与1 uL ƛDE3 phage lysate，3.3 ul helper phage lysate，1 uL selection phage lysate于37 ℃水浴30 min。（由于所取三种裂解液量较少， ...

是啊  我就是完全按照说明书做的，都没什么结果，所以很郁闷

谢谢你的指点啊，我再去试试，希望能有好结果

顺便问一下，你这三种lysate的配比是根据什么来的啊
赞一下 回复此楼
7楼2011-03-16 21:13:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

susizheng

木虫 (著名写手)
nestzhao(金币+2): 2011-03-17 08:26:56
引用回帖:
Originally posted by nestzhao at 2011-03-16 21:13:58:
是啊  我就是完全按照说明书做的，都没什么结果，所以很郁闷

谢谢你的指点啊，我再去试试，希望能有好结果

顺便问一下，你这三种lysate的配比是根据什么来的啊

说明书上的那个滴度单位看不大懂，这个量是另外查资料，找的经验值。
赞一下 回复此楼
8楼2011-03-16 22:04:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

nestzhao

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2011-03-16 22:04:32:
说明书上的那个滴度单位看不大懂，这个量是另外查资料，找的经验值。

恩  好的  谢谢了  希望这次能成功
赞一下 回复此楼
9楼2011-03-17 08:26:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

nestzhao

木虫 (小有名气)
rainwander: 引用回复的时候，引用你自己的帖子了？~ 2011-03-26 17:45:23
引用回帖:
Originally posted by nestzhao at 2011-03-17 08:26:45:
恩  好的  谢谢了  希望这次能成功

不好意思再向你请教一下：

我又重新试了下，按照你的方法，我在平板上得到了合适数量的菌落

但是，在下一步进行溶源化鉴定的时候，仍旧没有出现噬菌斑：也就是说明书所说的溶源化后的菌，在加入tester phage  后用双层平板法，在只有LB的平板上出现的噬菌斑较小，在含有IPTG的平板上能够有较大的噬菌斑。但是，我做的情况是，出现的菌落验证时两种平板都没有出现噬菌斑，而试剂盒里面的HMS174(DE3) Positive Control Glycerol Stock，也没有出现噬菌斑，而我们实验室已有的E coli BL21（DE3）在两个平板上出现噬菌斑，描述和说明书一致。

我就是很迷茫。。。。。
赞一下(1人) 回复此楼
10楼2011-03-25 21:43:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

nestzhao

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2011-03-16 14:09:00:
我找了下实验记录，
我的步骤是，OD长到0.5左右后，
3）取1uL菌液与1 uL ƛDE3 phage lysate，3.3 ul helper phage lysate，1 uL selection phage lysate于37 ℃水浴30 min。（由于所取三种裂解液量较少， ...

不好意思再向你请教一下：

我又重新试了下，按照你的方法，我在平板上得到了合适数量的菌落

但是，在下一步进行溶源化鉴定的时候，仍旧没有出现噬菌斑：也就是说明书所说的溶源化后的菌，在加入tester phage  后用双层平板法，在只有LB的平板上出现的噬菌斑较小，在含有IPTG的平板上能够有较大的噬菌斑。但是，我做的情况是，出现的菌落验证时两种平板都没有出现噬菌斑，而试剂盒里面的HMS174(DE3) Positive Control Glycerol Stock，也没有出现噬菌斑，而我们实验室已有的E coli BL21（DE3）在两个平板上出现噬菌斑，描述和说明书一致。

我就是很迷茫。。。。。

[ Last edited by nestzhao on 2011-3-26 at 18:48 ]
赞一下 回复此楼
11楼2011-03-26 18:46:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

susizheng

木虫 (著名写手)
nestzhao(金币+1): 2011-03-27 11:52:38
引用回帖:
Originally posted by nestzhao at 2011-03-26 18:46:55:
不好意思再向你请教一下：

我又重新试了下，按照你的方法，我在平板上得到了合适数量的菌落

但是，在下一步进行溶源化鉴定的时候，仍旧没有出现噬菌斑：也就是说明书所说的溶源化后的菌 ...

平板上得到了合适数量的菌落

这些菌落生长到比较大的时候，形态上有差异吗？
我做到这一步，直接挑取未出现噬菌斑的菌落做表达了。没有鉴定。
赞一下 回复此楼
12楼2011-03-27 11:21:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

nestzhao

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2011-03-27 11:21:44:
平板上得到了合适数量的菌落

这些菌落生长到比较大的时候，形态上有差异吗？
我做到这一步，直接挑取未出现噬菌斑的菌落做表达了。没有鉴定。

形态上没发现什么差异
而且关于这一步的噬菌斑，我也没发现
我做了多个不同的梯度，两个中间梯度产生了合适的菌落数量，比他们的前后梯度的菌落数量都要少，所以我以为是得到了溶源化的菌，进行了一些验证
而且，根据说明书，我以为是selection phage lysate能够把非溶原化的菌在水浴侵染过程中，直接裂解掉而不会产生噬菌斑


另外，我还想问一下，有没有方法可以知道，或者说是查到，某一株菌是不是male strain（带 F‘）
赞一下 回复此楼
13楼2011-03-27 12:16:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

susizheng

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★
nestzhao(金币+1): 2011-03-27 15:15:25
rainwander(金币+5): 鼓励交流~~很热心啊 2011-03-27 17:59:31
如果溶原化后涂板，平板上单菌落长大后就可以可以有差别了，溶原成功的菌落平滑，未溶原的菌落有噬菌斑。

另外，我还想问一下，有没有方法可以知道，或者说是查到，某一株菌是不是male strain（带 F‘）
查该菌的基因型。
赞一下(1人) 回复此楼
14楼2011-03-27 14:20:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

nestzhao

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2011-03-27 14:20:19:
如果溶原化后涂板，平板上单菌落长大后就可以可以有差别了，溶原成功的菌落平滑，未溶原的菌落有噬菌斑。

另外，我还想问一下，有没有方法可以知道，或者说是查到，某一株菌是不是male strain（带 F‘）
查该 ...

继续去试试，希望这次能有好运，做实验做的纠结死了
赞一下 回复此楼
15楼2011-03-27 15:16:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

nestzhao

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2011-03-27 14:20:19:
如果溶原化后涂板，平板上单菌落长大后就可以可以有差别了，溶原成功的菌落平滑，未溶原的菌落有噬菌斑。

另外，我还想问一下，有没有方法可以知道，或者说是查到，某一株菌是不是male strain（带 F‘）
查该 ...

再问一个，溶源化构建时，多少时间能够看到噬菌斑

多谢了啊
赞一下 回复此楼
16楼2011-03-29 08:58:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

susizheng

木虫 (著名写手)
nestzhao(金币+1): 2011-04-25 22:46:01
引用回帖:
Originally posted by nestzhao at 2011-03-29 08:58:05:
再问一个，溶源化构建时，多少时间能够看到噬菌斑

多谢了啊

尽量让菌落长得比较明显就可以看得见了。菌落直径1-2 mm吧。
赞一下 回复此楼
17楼2011-03-29 09:22:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

山水88

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
680087楼: Originally posted by susizheng at 2011-03-16 14:09:00
我找了下实验记录，
我的步骤是，OD长到0.5左右后，
3）取1uL菌液与1 uL ƛDE3 phage lysate，3.3 ul helper phage lysate，1 uL selection phage lysate于37 ℃水浴30 min。（由于所取三种裂解液量较少，可 ...

大侠好，问下你做验证的时候你是怎么操作的呀，谢谢
赞一下 回复此楼
18楼2012-11-08 15:09:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小鼹鼠

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
17楼: Originally posted by susizheng at 2011-03-29 09:22:13
尽量让菌落长得比较明显就可以看得见了。菌落直径1-2 mm吧。

您好！请问做溶原化的时候要注意什么操作方面的细节吗？因为实验室基本都是做大肠的，在做溶原化之前和之后超净台需不需要什么额外的处理呢？谢谢！
赞一下 回复此楼
19楼2018-01-02 10:54:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 nestzhao 的主题更新
191/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 h4CP7TrQR8Lg 2026-08-22 5/250 2026-08-23 12:09 by LR9qGULyN2ew
[基金申请] 什么时候开奖？ +9 CrisMessi 2026-08-18 10/500 2026-08-23 12:03 by 丶昵称占用
[教师之家] 跳槽后在研项目怎么办？ +5 简单化xn 2026-08-22 9/450 2026-08-23 10:59 by Tide man
[基金申请] 2026国自然函评费到账 +15 羊腰板 2026-08-21 16/800 2026-08-23 10:45 by process2012
[基金申请] 今天放榜吗？ +15 布布和一二 2026-08-19 16/800 2026-08-23 09:55 by 张春生
[博后之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 DpSrDtM079iu 2026-08-22 5/250 2026-08-23 04:07 by OEbVnUOu01ol
[论文投稿] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-22 4/200 2026-08-23 04:04 by OEbVnUOu01ol
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-22 7/350 2026-08-23 03:55 by OEbVnUOu01ol
[论文投稿] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-22 5/250 2026-08-23 03:52 by OEbVnUOu01ol
[考博] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 DpSrDtM079iu 2026-08-22 3/150 2026-08-23 00:55 by OEbVnUOu01ol
[基金申请] 范进中举一文的中心思想 +3 zjuhero 2026-08-22 4/200 2026-08-22 20:02 by mycsru
[教师之家] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 2JOx3r2CYEgw 2026-08-21 4/200 2026-08-22 16:52 by sunzitan
[基金申请] 人气不行了 +8 fansofjerry 2026-08-21 8/400 2026-08-22 16:30 by zyqchem
[基金申请] 时间戳今天，20号变了 +5 archvillain 2026-08-20 5/250 2026-08-22 06:12 by hui_daxiao
[基金申请] 建议基金发布提前给出明确的时间点 +10 kulium 2026-08-21 13/650 2026-08-21 21:58 by alongwaytogo
[基金申请] 看来今天不会放榜了？ +8 chengyan1220 2026-08-21 11/550 2026-08-21 17:52 by dcqxinyang
[基金申请] 时间戳又变了 +13 wuchongjun 2026-08-20 19/950 2026-08-21 17:21 by 紫杉醇
[基金申请] 我面上完蛋了 +7 且听虎啸 2026-08-20 8/400 2026-08-21 12:31 by 酷酷墨镜
[基金申请] 估计是周四 +3 archvillain 2026-08-18 3/150 2026-08-21 01:48 by jnhyjjm
[基金申请] 重要消息，中午系统在维护 +11 yuleib84 2026-08-18 12/600 2026-08-20 11:09 by xskun
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭