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lorlarhuan

木虫 (初入文坛)

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[交流] 【求助/交流】Westen blot问题请教已有8人参与

请问各位前辈，大家在做westen blot时，跑胶之后转膜，大家都是用什么方法呢？是半干转还是湿转，条件是怎样确定的呢？转完之后是不是根据预染Marker来判断蛋白是否转过去了呢？我在转膜之后的滤纸上有看到比较清晰的预染Marker条带，是否意味着转过了呢？

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1楼 2011-03-07 10:21:43

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小小1982

新虫 (初入文坛)

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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
最爱花诗雨(金币+1): 额~~这个可以整理下作为资源帖 2011-03-07 18:35:07

Q1：RNase 是RNA制备的杀手
A1：在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定，一般反应不需要辅助因子。因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解，而所制备的 RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以RNA的制备与分析操作难度极大。
在实验中，一方面要严格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。
防止RNA酶污染的措施
1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6h或更长时间。
2. 塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。
3. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。
4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12h以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。
5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。
6. 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。
常用的RNA酶抑制剂
1.  焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。
2.  异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。
3.  氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。
4.  RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。
5.  其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。
Q2：无RNA沉淀
A2: 原因可能如下：
1. 匀浆不完全：匀浆不完全时，基因组DNA分子仍然很大，溶液粘稠。变性的蛋白质和基因组DNA一起形成絮状凝集物容易包裹RNA，使之不能有效地释放到溶液中。
2..沉淀不完全：从小于2×105动/植物细胞、小于2mg动物组织、小于4mg植物组织或RNA含量低的动/植物组织中提取RNA时，匀浆体积太大，将造成RNA过分稀释而不能沉淀下来。当从这样的样品中提取RNA时，应按比例减少抽提溶液。
Q3：抽提率低
A3：原因可能如下：
1.系统超负荷：如果过多增加单位体积内的样品量，将引起系统超负荷。系统超负荷常导致匀浆不完全、单位体积内的DNA和蛋白质所占比例增大，使RNA不能有效地释放到上清中。系统超负荷还会导致相分离困难，降低RNA沉淀效率。
2.样品均化或裂解不完全: 匀浆不完全时，RNA分子易被蛋白质和基因组DNA复合物包裹，不能被有效释放。
3.终RNA不完全溶解:未溶解的RNA丢失。
4.样品未及时处理或细胞生长过度：样品分离后短时间内细胞内RNA酶被激活，细胞生长过度同样会激活细胞内RNA酶，若不及时提取RNA，大部分RNA会被降解。若样品暂时不作RNA提取，应立即用液氮冷冻完全，置-80℃贮存。
Q4:如何判定分离的总RNA的纯度？
A4:需要从两个方面着手，缺一不可，特别是新手（1）测定OD260/OD280的比值，测定时，RNA需要用10mM Tris-HCl,pH7.5稀释。理想的RNA, OD260/280在1.9-2.1之间。比值如果过低，可能有蛋白质污染，过高RNA可能已发生降解。（2）琼脂糖变性电泳观察rRNA的完整性和强度。变性电泳需要采用MOPS系统，不可以采用DNA 电泳用的TBE或TAE系统。如果OD260/OD280过低（<1.7），通常可以通过减少组织和细胞的用量来实现。
Q5：如何除去纯化的RNA中微量的基因组DNA。
A5：无论用种方式制备的总RNA,要绝对保证不含基因组DNA是不现实的。如果您希望得到DNA free 的RNA样品，需要用RNase free的DNase I处理。
Q6：纯化的RNA样品如何保存？
A6：如果希望得到最佳的结果，纯化的RNA需要立即用于下游实验。RNA可以保存在-80C冰箱，长期保存可以置于液氮中。如果没有-80冰箱或液氮，RNA也可以保存在异丙醇或乙醇中，-20度保存。
Q7： RNA降解原因
A7：原因可能如下：
1. 新鲜细胞：如果没有问题，且外源性污染也可以排除，那么降解几乎都来自裂解液的用量不足。如果将裂解液直接加入培养皿中裂解细胞，一定要使裂解液能覆盖住细胞。
2. 新鲜组织：某些富含内源核酸酶的样品(如肝脏，胸腺等)，即使使用电动匀浆器匀浆也不能避免RNA的降解。更可靠的方法是：在液氮条件下将组织研碎，并且匀浆时使用更多裂解液。
3. 冷冻样品：样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后移至-70℃冰箱保存。样品决不能未经液氮速冻而直接保存于-70℃冰箱中。冷冻样品，即使是冷冻细胞，如果不在液氮条件下研磨碎，而直接加入裂解液中匀浆，RNA也比新鲜样品更容易降解。样品在与裂解液充分接触前决不能出现融化，所以研磨用具必须预冷，在碾磨过程中要及时补充液氮。样品研碎后，在液氮刚刚挥发完时，将样品迅速转移到含裂解液的容器中，立即混匀匀浆。
4. 外源RNA酶的污染：，器械及实验环境中的RNA酶进入实验系统。
5. 内源RNA酶的污染：抑制剂失效或者用量不够，实验样品过多；匀浆时温度过高。
试验中我使用的总RNA抽提试剂为SunshineBio 总RNA提取试剂是生兴生物有限公司提供的，该试剂是一种广谱型总RNA抽提试剂，可在1小时内从动植物组织、微生物、培养细胞等各类样品中抽提总RNA。该试剂能充分裂解样品，并有效抑制细胞内核酶活性，保证了所提取总RNA的纯度及完整性。