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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】蛋白质含量测定
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lsx08

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】蛋白质含量测定

我想用凝胶柱分离不同分子量的蛋白质，结果很不理想，分离不开，不知有没有做过这方面的高手可以指点一下，谢谢！
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1楼 2011-03-05 13:34:35
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
★ ★ ★
amisking(金币+2): 鼓励发帖交流。 2011-03-05 19:09:52
翱宇(金币+1): 鼓励交流！ 2011-03-05 22:11:47
lsx08(金币+1): 2011-03-07 08:39:39
lsx08(金币+1): 2011-03-07 14:36:51
凝胶柱的选择很重要，不同型号分离范围不一样的。如果两个蛋白分子量相差不是很的话，还是选择其他的方法分离，效果会好点。
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2楼2011-03-05 18:18:02
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cjl2fl

金虫 (正式写手)
是不是吸附有问题，或者纯化的方法要换下？
试试CMC株呢？
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3楼2011-03-05 21:12:46
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vmuch520

至尊木虫 (文坛精英)
我完全不懂这个...
什么电泳法。。。行不？
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4楼2011-03-05 21:36:57
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zhengfan1109

银虫 (正式写手)
lsx08(金币+1): 2011-03-07 08:40:04
不同填料的凝胶柱分离范围不一样 效果差别很大。你可以换其他柱子试一试。应该会有比较理想的效果。
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5楼2011-03-05 23:52:29
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lisa68320

新虫 (初入文坛)
★ ★
lstt09nk(金币+2): 鼓励交流 2011-03-06 15:09:07
lsx08(金币+1): 2011-03-07 08:38:47
安马西亚生产的分子筛有多种规格，网上也可以查到，你可以准确的选取可以区分不同分子量的柱子，比如说我们实验室常常用于分离30-70KD的蛋白，那么我们一般用superdex200就可以有很好的效果，但是如果想分离几KD和十几KD的蛋白，我们就会换成superdex75，总之你要确定自己的蛋白分子量再选择合适的柱材
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6楼2011-03-06 12:46:31
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lsx08

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by lisa68320 at 2011-03-06 12:46:31:
安马西亚生产的分子筛有多种规格，网上也可以查到，你可以准确的选取可以区分不同分子量的柱子，比如说我们实验室常常用于分离30-70KD的蛋白，那么我们一般用superdex200就可以有很好的效果，但是如果想分离几KD和 ...

我要分离的是10KD~40KD的蛋白质，但是样品中的蛋白质含量很低，根本不出峰，加大样品浓度也不行，这该怎么办呢？还有就是你们实验室用的色谱条件（流动相、流速等）能否赐教一下？十分感谢！
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7楼2011-03-07 08:45:13
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lisa68320

新虫 (初入文坛)
★ ★
看天(金币+2): 鼓励交流 2011-03-07 11:13:33
lsx08(金币+2): 2011-03-07 14:19:29
引用回帖:
Originally posted by lsx08 at 2011-03-07 08:45:13:
我要分离的是10KD~40KD的蛋白质，但是样品中的蛋白质含量很低，根本不出峰，加大样品浓度也不行，这该怎么办呢？还有就是你们实验室用的色谱条件（流动相、流速等）能否赐教一下？十分感谢！

浓度低不出峰只能说明你的样本太稀，可能需要你将样本加倍浓缩才行。我们一般都会用milipore公司的浓缩装置浓缩样本然后上样。条件因蛋白而异，也根据你后续实验而异，只要不会使蛋白发生变形就行。祝你好运
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8楼2011-03-07 09:53:37
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lsx08

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by lxj341401 at 2011-03-05 18:18:02:
凝胶柱的选择很重要，不同型号分离范围不一样的。如果两个蛋白分子量相差不是很的话，还是选择其他的方法分离，效果会好点。

我想在保持蛋白质活性的情况下将其与杂蛋白分离，杂蛋白的含量很低且分子量相差的不是很大，不知你有没有什么方法可以推荐？谢谢指教！
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9楼2011-03-07 14:36:26
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lsx08

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by cjl2fl at 2011-03-05 21:12:46:
是不是吸附有问题，或者纯化的方法要换下？
试试CMC株呢？

我感觉是样品中杂蛋白含量太低，检测不出HPLC峰
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10楼2011-03-07 14:45:29
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lsx08

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by vmuch520 at 2011-03-05 21:36:57:
我完全不懂这个...
什么电泳法。。。行不？

电泳方法做了，现在想用HPLC做
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11楼2011-03-07 14:46:06
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by lsx08 at 2011-03-07 14:36:26:
我想在保持蛋白质活性的情况下将其与杂蛋白分离，杂蛋白的含量很低且分子量相差的不是很大，不知你有没有什么方法可以推荐？谢谢指教！

离子交换和疏水层析等都可以分开的。
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13楼2011-03-07 16:04:27
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cjl2fl

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
可以这样做的，如果杂蛋白太多，可以过下柱子，初步纯化下蛋白，再超滤浓缩，这样应该能测到的吧？
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14楼2011-03-07 16:56:15
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lsx08

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by lsx08 at 2011-03-07 14:45:29:
我感觉是样品中杂蛋白含量太低，检测不出HPLC峰

我配制的溶液是10mg/ml，目的蛋白的峰已经出现了平头峰，杂蛋白还是没有出峰，该怎么办呢？
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15楼2011-03-08 08:52:01
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lsx08

新虫 (初入文坛)
自己顶一下，希望高手们多多发表意见
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16楼2011-03-14 11:15:44
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小小198212楼
2011-03-07 15:00   回复  
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