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dhmdddd

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】请教关于毕赤酵母表达外源基因

各位大虾，本人最近在构建一株  表达原核菌株一个酶  的毕赤酵母重组菌，现在菌株已经得到一批，之前通过提取染色体进行PCR验证，用的是目的基因的引物，结果是有的，但是用AOX引物进行PCR的时候，结果总是和文献上面说的不对应，想着先摇下瓶看看，结果摇瓶结果的表达量是奇低啊，特别特别低，我后面是用3%的甲醇诱导的，按理说应该是有结果的，唉，照着这个速度下去，我真是怀疑自己到时候毕不了业啊！！！！希望各位高手指导一二，不胜感激~
哦，还有能不能用硫酸铵浓缩一下啊？我也看了一些资料，具体有高手用过这种方法没有？能否介绍下？再次感谢！！

[ Last edited by dhmdddd on 2011-2-28 at 15:32 ]
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1楼 2011-02-28 15:30:40
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
dhmdddd(金币+1): 还是十分感谢~ 2011-03-01 10:50:36
只做过原核表达，正在学习昆虫细胞表达，酵母至今还没做过。。。帮不上忙
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2楼2011-02-28 17:23:16
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susizheng

木虫 (著名写手)
dhmdddd(金币+1): 谢谢~ 2011-03-01 10:50:52
目的基因用AOX引物扩增的话，可能不是很好扩增，当时用的TD-PCR做的，效果很好。
另外不知道原核的基因为啥选择真核表达系统呢？用原核表达系统不是又方便，而且密码子的偏好性可能更好。
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3楼2011-02-28 21:29:09
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dhmdddd

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2011-02-28 21:29:09:
目的基因用AOX引物扩增的话，可能不是很好扩增，当时用的TD-PCR做的，效果很好。
另外不知道原核的基因为啥选择真核表达系统呢？用原核表达系统不是又方便，而且密码子的偏好性可能更好。

因为想利用毕赤酵母的分泌表达，最近也想换表达体系了，就是还没有想好！谢谢！哦，还有你用TD-PCR是P  AOX的吗？

[ Last edited by dhmdddd on 2011-3-1 at 10:53 ]
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4楼2011-03-01 10:51:51
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w.king124

金虫 (正式写手)
★
dhmdddd(金币+2): 我的载体是我自己构建的，那我试着加大一下溶氧？本来以为加大甲醇诱导会提高表达，忽略了溶氧…… 2011-03-01 11:56:31
rainwander(金币+1): 鼓励积极参与交流~~~ 2011-03-01 13:48:28
1.你的载体是新构建的还是以前实验室就有的啊
2.你的甲醇含量比较高，在摇动过程中溶氧被大量消耗，会导致表达量低
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5楼2011-03-01 11:07:28
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susizheng

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by dhmdddd at 2011-03-01 10:51:51:
因为想利用毕赤酵母的分泌表达，最近也想换表达体系了，就是还没有想好！谢谢！哦，还有你用TD-PCR是P  AOX的吗？

[ Last edited by dhmdddd on 2011-3-1 at 10:53 ]

恩，是的。
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6楼2011-03-01 12:48:26
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