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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】请大家帮忙分析一下PCR结果，谢谢！
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sxxuan

金虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】请大家帮忙分析一下PCR结果，谢谢！ 已有9人参与

做PCR扩增，结果出现如图的情况，我都不知道怎么分析了，请大家帮帮忙，谢谢！
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你的日子如何，你的力量也必如何！
1楼 2011-02-24 16:47:12
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sxxuan

金虫 (著名写手)
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Originally posted by love_st at 2011-02-24 16:50:04:
说详细点啊，片段多大等等

不好意思啊没说清楚。
这是由两个模板拼接在一起的，片段大小450左右，marker是100bp的～
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3楼2011-02-24 17:20:40
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by wqj1988926 at 2011-02-24 19:06:37:
这拖尾现象也太严重了，或者说DNA已经被破坏成梯度化

我也怀疑是模板被降解了，不过前一天下午才扩增出来的模板，而且是放在-80保存，第二天马上就上机了
不过体系是前一天配好的，有没有关系？
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7楼2011-02-25 11:09:41
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sxxuan

金虫 (著名写手)
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Originally posted by hzkui602 at 2011-02-24 21:33:05:
胶可能没制好！

marker好像也有一点拖尾，不过看起来还好
会不会是电泳缓冲液用太久了？因为胶不是我配的也不是我跑的，所以这些原因我都不能排除
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8楼2011-02-25 11:11:44
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sxxuan

金虫 (著名写手)
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Originally posted by sxxuan at 2011-02-24 16:47:12:
做PCR扩增，结果出现如图的情况，我都不知道怎么分析了，请大家帮帮忙，谢谢！

PCR条件：94度预变性 2min，93度30s，55度30s，72度30s，35 cycles，最后72度延伸7min

MBI体系，酶是Fementas的taq 酶吧

下机后就用2%的胶去跑～
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9楼2011-02-25 11:17:21
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by wqj1988926 at 2011-02-25 11:19:16:
有可能是缓冲液的时间太久，我们实验室有人好像遇到过这样的问题

嗯，下次我会注意点的～
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11楼2011-02-25 11:27:14
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sxxuan

金虫 (著名写手)
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Originally posted by woshishao at 2011-02-25 12:56:54:
首先问楼主个问题，你的电泳跑时电压时多少？
然后对于楼主的PCR电泳图，我也出现过类似的情况。
经过个人总结，简称“涂布状条带”。
产生原因：1.PCR引物特异性不足，PCR扩增产生很多杂带，在电泳时如果使用 ...

分析得很详细啊，谢谢！
跑电泳的电泳一般都是120V。
引物的特异性怎样这个问题就难了，因为已经换了好几对引物了。从12月做到现在一直都没有出来结果
操作的话，好像也没有特别不小心的地方。
至于其中一个模板确实是过年前就准备好的，放在-80度保存了好久
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15楼2011-02-25 15:47:28
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by woshishao at 2011-02-25 13:01:13:
还忘记问个问题了：你这个是不是融合PCR啊？我记得这种PCR很容易出现这个情况

什么是融合PCR？
我做的是先把两段序列分别扩增出来，然后再用中间引物把两段序列拼接在一起，成为一个序列
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你的日子如何，你的力量也必如何！
16楼2011-02-25 15:49:20
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sxxuan

金虫 (著名写手)
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Originally posted by silicare at 2011-02-25 13:00:50:
换引物吧，是引物降解了

引物是新合成的
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17楼2011-02-25 15:49:58
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sxxuan

金虫 (著名写手)
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Originally posted by woshishao at 2011-02-26 21:06:28:
看图，这个就是融合PCR，你说你是把两个基因拼成已个基因，应该就是融合PCR了。这种PCR是这样的，引物特异性问题有点不好把握，容易出现这种情况。而且就算扩增出目的条带，也比较浅，建议使用80V来跑电泳，而且多 ...

啊，做到就是这种PCR，实在太感谢了！
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你的日子如何，你的力量也必如何！
21楼2011-02-28 09:18:50
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