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wuw579

铁杆木虫 (正式写手)

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虫号: 1188591

[交流] 【求助/交流】PCR问题

我欲设计两种PCR：模板引物试剂程序都完全一样
1、40个循环
2、先20个循环，取出1微升为模板再20个循环
谁能告诉我产物量有什么区别

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1楼 2011-02-17 15:42:17

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+3): 热心的淀粉酶 2011-02-21 22:13:49

产物量有无变化都有可能，因为有些因素都已经改变了。40个连续循环能得到的产物，改为两段PCR后减少甚至完全得不到，又或者会变得更多。

1、因为在40个PCR后还有个总延伸阶段，如果聚合酶活力下降效率降低，或者聚合碱基的速度降低，那么聚合成的单链将会在3撇端截短，此阶段可以以两条单链各为模板将各自3撇端补全，消除部分单链而成完整双链。如果20个循环后取出产物作为模板，那么就要用第一个循环来补全模板，少了一个有效的循环，导致最终产物减少二分之一。

2、分段PCR补充了聚合酶和dNTP，使得产物变多，不过一般来说dNTP都会够的，一般不会少，主要可能是聚合酶钝化，可能需要补充。

3、模板的量变化，这会导致不确定性。明明是摸索好的东西，改变了就难说了，可能更合适或者更不合适，所以导致产物变多还是变少都难说。

所以说难说啊，你就试一次吧，实验就是要摸索的，谁都知道的结果就不好玩了。

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