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wuw579

铁杆木虫 (正式写手)


[交流] 【求助/交流】PCR问题

我欲设计两种PCR:模板 引物 试剂 程序都完全一样
1、40个循环
2、先20个循环,取出1微升为模板再20个循环
谁能告诉我产物量有什么区别
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小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+3): 热心的淀粉酶 2011-02-21 22:13:49

产物量有无变化都有可能,因为有些因素都已经改变了。40个连续循环能得到的产物,改为两段PCR后减少甚至完全得不到,又或者会变得更多。

1、因为在40个PCR后还有个总延伸阶段,如果聚合酶活力下降效率降低,或者聚合碱基的速度降低,那么聚合成的单链将会在3撇端截短,此阶段可以以两条单链各为模板将各自3撇端补全,消除部分单链而成完整双链。如果20个循环后取出产物作为模板,那么就要用第一个循环来补全模板,少了一个有效的循环,导致最终产物减少二分之一。

2、分段PCR补充了聚合酶和dNTP,使得产物变多,不过一般来说dNTP都会够的,一般不会少,主要可能是聚合酶钝化,可能需要补充。

3、模板的量变化,这会导致不确定性。明明是摸索好的东西,改变了就难说了,可能更合适或者更不合适,所以导致产物变多还是变少都难说。

所以说难说啊,你就试一次吧,实验就是要摸索的,谁都知道的结果就不好玩了。
4楼2011-02-21 21:37:05
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