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姜大磊

木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】质粒电泳,大家来看看已有10人参与

BL21转入pET-28a表达载体,摇菌后,提质粒,电泳总是2-3条带,原本要用回收后的质粒酶切,提了好几次,都跑不出单一的条带来。 同时,我提取质粒后,直接酶切,电泳出来结果也是好几条带,无法回收(酶切位点只有一个,并且正确选择的酶—)  请高手指教!
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

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★ ★ ★
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dhd997(金币+2):谢谢交流 2011-01-16 09:38:52
无图无真相啊  
质粒2-3条带正常  但是单酶切后如果不是一条带的话 就不正常了
几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
2楼2011-01-15 17:10:52
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姜大磊

木虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by fungixx at 2011-01-15 17:10:52:
无图无真相啊  
质粒2-3条带正常  但是单酶切后如果不是一条带的话 就不正常了

我做的是双酶切分步酶切,Sal I 和EcoRI,分别是1.5小时和1小时,也是出来多条带,怎么回事啊,谢谢!
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3楼2011-01-15 17:22:00
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ben1147

木虫 (正式写手)

★ ★ ★
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dhd997(金币+2):good 2011-01-16 09:38:35
引用回帖:
Originally posted by 姜大磊 at 2011-01-15 17:22:00:

我做的是双酶切分步酶切,Sal I 和EcoRI,分别是1.5小时和1小时,也是出来多条带,怎么回事啊,谢谢!

分析分析各条带的大小关系,是空载体还是有插入片段的?
再看看酶切体系和条件,EcoRI比较容易出star activity
4楼2011-01-15 22:47:07
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姜大磊

木虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by ben1147 at 2011-01-15 22:47:07:

分析分析各条带的大小关系,是空载体还是有插入片段的?
再看看酶切体系和条件,EcoRI比较容易出star activity

质粒是空载体,我酶切后,为了连接目的基因的,切下来的片段也就6bp左右,电泳就跑没了,上楼朋友说即使单跑质粒出现2-3条带也是正常的,但是酶切后应该是单一条带,而我的酶切后2-3条带,奇怪,这样的话我无法回收做连接。
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5楼2011-01-16 10:35:22
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dream-fish

银虫 (小有名气)


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先保证质粒是正确的,实验室有没有人成功过?其次,如果别人能成功,那考虑用他用过的酶做一次,验证你的质粒和酶是否正确。最后一招:换个公司的酶
6楼2011-01-16 11:13:17
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pidou213

木虫 (正式写手)

木有图片啊
见得多爱的多
7楼2011-01-16 11:40:39
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姜大磊

木虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by dream-fish at 2011-01-16 11:13:17:
先保证质粒是正确的,实验室有没有人成功过?其次,如果别人能成功,那考虑用他用过的酶做一次,验证你的质粒和酶是否正确。最后一招:换个公司的酶

实验室以前没有用这个质粒酶切过,这种质粒是今年刚买进来的,质粒大约5.4Kbp 酶切后出来一条大的带大概符合要求,但是底下还有一条1000bp左右的带,无法解释。分步酶切的SalI和EcoRI 分别1.5h和1h
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8楼2011-01-16 11:44:30
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9楼2011-01-16 12:44:31
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姜大磊

木虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by zyxme at 2011-01-16 12:44:31:

你这笑···?  倒是指教一下下啊
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10楼2011-01-16 15:07:44
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