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姜大磊

木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】质粒电泳，大家来看看 已有10人参与

BL21转入pET-28a表达载体，摇菌后，提质粒，电泳总是2-3条带，原本要用回收后的质粒酶切，提了好几次，都跑不出单一的条带来。 同时，我提取质粒后，直接酶切，电泳出来结果也是好几条带，无法回收（酶切位点只有一个，并且正确选择的酶—）  请高手指教！
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Nevergiveup,neverslowdown;Nevergrowold,nevereverdieyoung......
1楼 2011-01-15 16:22:58
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主
★ ★ ★
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dhd997(金币+2):谢谢交流 2011-01-16 09:38:52
无图无真相啊  
质粒2-3条带正常  但是单酶切后如果不是一条带的话 就不正常了
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
2楼2011-01-15 17:10:52
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姜大磊

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by fungixx at 2011-01-15 17:10:52:
无图无真相啊  
质粒2-3条带正常  但是单酶切后如果不是一条带的话 就不正常了

我做的是双酶切分步酶切，Sal I 和EcoRI，分别是1.5小时和1小时，也是出来多条带，怎么回事啊，谢谢！
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3楼2011-01-15 17:22:00
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ben1147

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+2):good 2011-01-16 09:38:35
引用回帖:
Originally posted by 姜大磊 at 2011-01-15 17:22:00:

我做的是双酶切分步酶切，Sal I 和EcoRI，分别是1.5小时和1小时，也是出来多条带，怎么回事啊，谢谢！

分析分析各条带的大小关系，是空载体还是有插入片段的?
再看看酶切体系和条件，EcoRI比较容易出star activity
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4楼2011-01-15 22:47:07
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姜大磊

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by ben1147 at 2011-01-15 22:47:07:

分析分析各条带的大小关系，是空载体还是有插入片段的?
再看看酶切体系和条件，EcoRI比较容易出star activity

质粒是空载体，我酶切后，为了连接目的基因的，切下来的片段也就6bp左右，电泳就跑没了，上楼朋友说即使单跑质粒出现2-3条带也是正常的，但是酶切后应该是单一条带，而我的酶切后2-3条带，奇怪，这样的话我无法回收做连接。
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5楼2011-01-16 10:35:22
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dream-fish

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
先保证质粒是正确的，实验室有没有人成功过？其次，如果别人能成功，那考虑用他用过的酶做一次，验证你的质粒和酶是否正确。最后一招：换个公司的酶
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6楼2011-01-16 11:13:17
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pidou213

木虫 (正式写手)
木有图片啊
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见得多爱的多
7楼2011-01-16 11:40:39
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姜大磊

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by dream-fish at 2011-01-16 11:13:17:
先保证质粒是正确的，实验室有没有人成功过？其次，如果别人能成功，那考虑用他用过的酶做一次，验证你的质粒和酶是否正确。最后一招：换个公司的酶

实验室以前没有用这个质粒酶切过，这种质粒是今年刚买进来的，质粒大约5.4Kbp 酶切后出来一条大的带大概符合要求，但是底下还有一条1000bp左右的带，无法解释。分步酶切的SalI和EcoRI 分别1.5h和1h
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8楼2011-01-16 11:44:30
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zyxme
9楼2011-01-16 12:44:31
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姜大磊

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zyxme at 2011-01-16 12:44:31:

你这笑···？  倒是指教一下下啊
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10楼2011-01-16 15:07:44
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