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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 专业学科区 » 转基因 » 【求助/交流】我做转基因,如何把质粒转入农杆菌中?
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完了

新虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】我做转基因,如何把质粒转入农杆菌中?

自己有农杆菌菌株,向外单位要了基因.还是签了协议的.
别人给我们的基因应该是质粒形态的还是整合在大肠杆菌里的?应该不会是简单的双链DNA吧,我想的话.

如果是整合在大肠杆菌里的,我该怎么把基因弄到农杆菌中去?
如果是质粒形态的,我该怎么把基因弄到农杆菌里面去?

我需要技术路线,和注意事项.....谢谢....具体实验操作可以网上搜索.
谢谢.
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1楼 2011-01-14 13:00:18
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ben1147

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
完了(金币+1):谢谢参与
rainwander(金币+2):很详细啊，鼓励积极参与交流~~~ 2011-01-14 14:18:35
一般应该都是质粒吧，但是要看目的基因所在的质粒是什么质粒。如果是已经构建好的双元载体，那直接摇起来，提了质粒，转到农杆菌里就行
要是只是一般的克隆用的大肠的质粒，那要提了质粒，把目的基因切下来或者P下来，然后连到双元载体上，转化大肠，挑克隆提质粒验证正确之后再转到农杆菌里
如果确实目的基因是在菌的染色体上，那就得先P，连克隆载体，再做亚克隆到双元载体上转化农杆菌。
具体哪种情况问问那个外单位，肯定是知道的。
至于质粒转化农杆菌，原理没什么特别的，和转大肠一样，只不过制备感受态的溶液氯化钙浓度不太一样，要低一些。另外就是大肠是冰浴、42热激，农杆菌是液氮冷冻，37热激。另外复苏、培养时间什么的也要延长
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2楼2011-01-14 13:39:45
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完了

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by ben1147 at 2011-01-14 13:39:45:
一般应该都是质粒吧，但是要看目的基因所在的质粒是什么质粒。如果是已经构建好的双元载体，那直接摇起来，提了质粒，转到农杆菌里就行
要是只是一般的克隆用的大肠的质粒，那要提了质粒，把目的基因切下来或者P ...

如果只是一般的克隆用的大肠的质粒,那我还需要索要一个双元载体吧?否则就要自己构建一个双元载体?
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3楼2011-01-14 15:27:15
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hyw1989960

木虫 (正式写手)
★
完了(金币+1):谢谢参与
双元载体是为了农杆菌介导转植物用的，如果只是简单的转到脓杆菌中，根本不需要这样，常用的转化方法都行，电转化、基因枪都很好转，氯化钙的当然也行，不过好像效率差一些，建议电转化。关于这方面的百度里很多
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4楼2011-01-14 17:21:38
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姜大磊

木虫 (小有名气)
★
完了(金币+1):谢谢参与
脓杆菌侵染法，和花粉管介导法
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5楼2011-01-14 18:00:13
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完了

新虫 (小有名气)
谢谢大家
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6楼2011-01-14 18:02:29
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ben1147

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by 完了 at 2011-01-14 15:27:15:

如果只是一般的克隆用的大肠的质粒,那我还需要索要一个双元载体吧?否则就要自己构建一个双元载体?

基本都是拿现成的双元载体（pBI系列，pCambia系列等等）改造，自己构建的话比较复杂，而且也没必要。真能搞出一个好用的载体，光这个就够发文章了
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7楼2011-01-14 18:09:41
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dream-fish

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
质粒转到农杆菌用冻融法就好了啊，很快的。感受态也很好做，去网上搜下农杆菌冻融法转化
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8楼2011-01-15 16:06:06
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