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完了

新虫 (小有名气)


[交流] 【求助/交流】我做转基因,如何把质粒转入农杆菌中?

自己有农杆菌菌株,向外单位要了基因.还是签了协议的.
别人给我们的基因应该是质粒形态的还是整合在大肠杆菌里的?应该不会是简单的双链DNA吧,我想的话.

如果是整合在大肠杆菌里的,我该怎么把基因弄到农杆菌中去?
如果是质粒形态的,我该怎么把基因弄到农杆菌里面去?

我需要技术路线,和注意事项.....谢谢....具体实验操作可以网上搜索.
谢谢.
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ben1147

木虫 (正式写手)


★ ★ ★
完了(金币+1):谢谢参与
rainwander(金币+2):很详细啊,鼓励积极参与交流~~~ 2011-01-14 14:18:35
一般应该都是质粒吧,但是要看目的基因所在的质粒是什么质粒。如果是已经构建好的双元载体,那直接摇起来,提了质粒,转到农杆菌里就行
要是只是一般的克隆用的大肠的质粒,那要提了质粒,把目的基因切下来或者P下来,然后连到双元载体上,转化大肠,挑克隆提质粒验证正确之后再转到农杆菌里
如果确实目的基因是在菌的染色体上,那就得先P,连克隆载体,再做亚克隆到双元载体上转化农杆菌。
具体哪种情况问问那个外单位,肯定是知道的。
至于质粒转化农杆菌,原理没什么特别的,和转大肠一样,只不过制备感受态的溶液氯化钙浓度不太一样,要低一些。另外就是大肠是冰浴、42热激,农杆菌是液氮冷冻,37热激。另外复苏、培养时间什么的也要延长
2楼2011-01-14 13:39:45
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完了

新虫 (小有名气)


引用回帖:
Originally posted by ben1147 at 2011-01-14 13:39:45:
一般应该都是质粒吧,但是要看目的基因所在的质粒是什么质粒。如果是已经构建好的双元载体,那直接摇起来,提了质粒,转到农杆菌里就行
要是只是一般的克隆用的大肠的质粒,那要提了质粒,把目的基因切下来或者P ...

如果只是一般的克隆用的大肠的质粒,那我还需要索要一个双元载体吧?否则就要自己构建一个双元载体?
3楼2011-01-14 15:27:15
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hyw1989960

木虫 (正式写手)



完了(金币+1):谢谢参与
双元载体是为了农杆菌介导转植物用的,如果只是简单的转到脓杆菌中,根本不需要这样,常用的转化方法都行,电转化、基因枪都很好转,氯化钙的当然也行,不过好像效率差一些,建议电转化。关于这方面的百度里很多
4楼2011-01-14 17:21:38
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姜大磊

木虫 (小有名气)



完了(金币+1):谢谢参与
脓杆菌侵染法,和花粉管介导法
5楼2011-01-14 18:00:13
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完了

新虫 (小有名气)


谢谢大家
6楼2011-01-14 18:02:29
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ben1147

木虫 (正式写手)



小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by 完了 at 2011-01-14 15:27:15:

如果只是一般的克隆用的大肠的质粒,那我还需要索要一个双元载体吧?否则就要自己构建一个双元载体?

基本都是拿现成的双元载体(pBI系列,pCambia系列等等)改造,自己构建的话比较复杂,而且也没必要。真能搞出一个好用的载体,光这个就够发文章了
7楼2011-01-14 18:09:41
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dream-fish

银虫 (小有名气)



小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
质粒转到农杆菌用冻融法就好了啊,很快的。感受态也很好做,去网上搜下农杆菌冻融法转化
8楼2011-01-15 16:06:06
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