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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】荧光定量PCR
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lij2

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】荧光定量PCR

引物设计时是55-56℃，合成出来是54℃了，探针温度比引物高。合成片段85bp。请教高手，退火温度从多少开始设置比较好？这么短的片段，是不是可以2步法进行？热链怎样设计比较好？谢谢~
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1楼 2010-12-22 19:15:37
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lij2

金虫 (小有名气)
继续求助~~~
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2楼2010-12-23 12:31:37
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love_st

金虫 (著名写手)
lij2(金币+1): 2010-12-24 19:26:10
引用回帖:
Originally posted by lij2 at 2010-12-22 19:15:37:
引物设计时是55-56℃，合成出来是54℃了，探针温度比引物高。合成片段85bp。请教高手，退火温度从多少开始设置比较好？这么短的片段，是不是可以2步法进行？热链怎样设计比较好？谢谢~

探针温度是多少，没关系的，退火可以先低点，55度吧，热链是什么？
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3楼2010-12-23 13:04:00
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yingnj

新虫 (初入文坛)
lij2(金币+1): 2010-12-24 19:26:22
合成片断短的话用2步法吧，可以设置成55或者56度。
热链是什么，不解~
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4楼2010-12-23 13:47:28
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)
先普通PCR试试
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5楼2010-12-23 13:49:00
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poog502

木虫 (正式写手)
lij2(金币+1):普通PCR出来了，想请教2步法 2010-12-24 19:29:18
先做预备试验，和普通PCR一样的，可以少跑几个循环比如20，跑个电泳看看结果如何。总之，出得来才是硬道理。
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6楼2010-12-23 13:53:26
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lij2

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yingnj at 2010-12-23 13:47:28:
合成片断短的话用2步法吧，可以设置成55或者56度。
热链是什么，不解~

试了下退火60°都可以出来，两步法的话，85bp时间多少比较合适呢？是不是变性95° 5s就够了？看到文献上有用5s变性的
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7楼2010-12-24 19:28:23
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poog502

木虫 (正式写手)
lij2(金币+2):多谢 2010-12-25 17:41:08
引用回帖:
Originally posted by lij2 at 2010-12-24 19:28:23:

试了下退火60°都可以出来，两步法的话，85bp时间多少比较合适呢？是不是变性95° 5s就够了？看到文献上有用5s变性的

反应程式为：第一步95℃预变性30s；第二步95℃变性5s，60℃反应31s,40个循环。
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8楼2010-12-24 20:08:43
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