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【求助】real time PCR 实验步骤及注意事项
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| 哪位做过real time PCR啊?能把详细步骤告诉在吗?还有注意事项,及自己的心得体会?呵呵,多谢了哈 |
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我的RT-PCR过程
xds手术刀(金币+8): 2010-12-11 21:59:59
xds手术刀(金币+5): 谢谢啊! 2011-03-14 12:57:03
xds手术刀(金币+5): 谢谢啊! 2011-03-14 12:57:03
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RNA提取实验前的准备 (1)使用器具:尽量使用一次性塑料器皿,必须使用玻璃器皿时应按照下列方法处理。 ①用0.1%的DEPC水溶液在37℃下处理12h。 ②然后在120℃下高压灭菌30min,以除去残留的DEPC。 (2)试剂的配制:用于RNA实验的试剂,需用干热灭菌(180℃,60min),或使用上述方法进行DEPC水处理灭菌后的玻璃容器盛装,使用的无菌水需用0.1%的DEPC处理后再进行高温高压灭菌。 注意:RNA实验用所有的试剂和无菌水都应该专用,避免交叉污染。实验中,戴一次性手套,使用RNA操作专用实验台,在操作过程中避免讲话,避免汗液和唾液中的RNA分解酶的污染。 样品的研磨与匀浆 ① 将超低温冻结的RNA提取样品(大鼠骨骼肌)称重后迅速转移至用液氮预冷的研钵中,用研钵研磨组织,期间不断加入液氮,直至研磨成粉末状(无明显的可见颗粒)。 ② 向研钵中加入适量的RNAiso Plus,将研磨成粉末状的样品完全覆盖,然后室温静置,直至样品完全融化,再用研杵继续研磨至裂解液呈透明状。 ③ 将匀浆液移至离心管,室温静置5min。 ④ 12 000g 4℃离心5min。 ⑤ 小心吸取上清液,移入新的离心管中,切勿吸取沉淀。 Total RNA的提取 ① 向上述步骤2中的匀浆裂解液中加入氯仿(RNAiso Plus的1/5体积量),盖紧离心管盖,用力振荡(氯仿沸点低、易挥发、震荡时应小心离心管盖突然弹开)。待充分乳化溶液呈乳白状(无分相现象)后,再室温静置5min。 ② 12 000g 4℃离心15min。 ③ 从离心机中小心取出离心管,此时匀浆液分3层,即无色的上清液、中间的白蛋白层及带有颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中(切忌取出白色中间层)。 ④ 向上清液中加入等体积的异丙醇,上下颠倒离心管,充分混匀后,在15~30℃静置10min。 ⑤ 12 000g 4℃离心10min。在离心后,试管底部会出现沉淀。 ⑥ RNA沉淀的清洗:小心弃去上清,缓慢的沿离心管壁加入75%的乙醇1ml(切勿触及沉淀),轻轻的上下颠倒洗涤离心管管壁,12,000g 4℃离心5min后小心弃去乙醇(为了更好的控制RNA中的盐离子量,应尽量除尽乙醇)。 RNA的溶解 室温干燥沉淀2~5min(不可以离心或者加热干燥,否则RNA很难溶解),加入适当的RNase-free水溶解沉淀,必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀,待RNA沉淀完全溶解后于-80℃保存。 TransScript First-Strand cDNA反转录试剂盒操作步骤 取1μg 总RNA,与100pmole(10pmole/μL)oligo dT(20)混匀,75℃变性10分钟,冰上退火,退火产物加DEPC水定容至20μL,全部加入Reverse transcript premix薄壁管中,42℃反应1小时,85℃灭活15秒。其产物为first-Strand cDNA,可直接作为模板用于定量反应。 Real-time PCR试剂盒操作步骤 QPCR Premix反应体系20μl,其成分为: SyBR Green Real-time PCR MasterM I X 10μl,混合溶液2μl,正反向引物共2.4μl,cDNA模板2μl,消毒去离子水3.6μl。反应条件:95℃ 预变性 30 s;95℃变性 5 s、60℃退火15s、72℃延伸45s,40个循环; -20℃ 保存。 |
2楼2010-12-11 01:13:57














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