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【求助】real time PCR 实验步骤及注意事项
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| 哪位做过real time PCR啊？能把详细步骤告诉在吗？还有注意事项，及自己的心得体会？呵呵，多谢了哈 |
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我的RT-PCR过程
xds手术刀(金币+8): 2010-12-11 21:59:59
xds手术刀(金币+5): 谢谢啊！ 2011-03-14 12:57:03
xds手术刀(金币+5): 谢谢啊！ 2011-03-14 12:57:03
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RNA提取实验前的准备 （1）使用器具：尽量使用一次性塑料器皿，必须使用玻璃器皿时应按照下列方法处理。 ①用0.1%的DEPC水溶液在37℃下处理12h。 ②然后在120℃下高压灭菌30min，以除去残留的DEPC。 （2）试剂的配制：用于RNA实验的试剂，需用干热灭菌（180℃，60min），或使用上述方法进行DEPC水处理灭菌后的玻璃容器盛装，使用的无菌水需用0.1%的DEPC处理后再进行高温高压灭菌。 注意：RNA实验用所有的试剂和无菌水都应该专用，避免交叉污染。实验中，戴一次性手套，使用RNA操作专用实验台，在操作过程中避免讲话，避免汗液和唾液中的RNA分解酶的污染。 样品的研磨与匀浆 ① 将超低温冻结的RNA提取样品（大鼠骨骼肌）称重后迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研钵研磨组织，期间不断加入液氮，直至研磨成粉末状（无明显的可见颗粒）。 ② 向研钵中加入适量的RNAiso Plus，将研磨成粉末状的样品完全覆盖，然后室温静置，直至样品完全融化，再用研杵继续研磨至裂解液呈透明状。 ③ 将匀浆液移至离心管，室温静置5min。 ④ 12 000g 4℃离心5min。 ⑤ 小心吸取上清液，移入新的离心管中，切勿吸取沉淀。 Total RNA的提取 ① 向上述步骤2中的匀浆裂解液中加入氯仿（RNAiso Plus的1/5体积量），盖紧离心管盖，用力振荡（氯仿沸点低、易挥发、震荡时应小心离心管盖突然弹开）。待充分乳化溶液呈乳白状（无分相现象）后，再室温静置5min。 ② 12 000g 4℃离心15min。 ③ 从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分3层，即无色的上清液、中间的白蛋白层及带有颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中（切忌取出白色中间层）。 ④ 向上清液中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管，充分混匀后，在15~30℃静置10min。 ⑤ 12 000g 4℃离心10min。在离心后，试管底部会出现沉淀。 ⑥ RNA沉淀的清洗：小心弃去上清，缓慢的沿离心管壁加入75%的乙醇1ml（切勿触及沉淀），轻轻的上下颠倒洗涤离心管管壁，12，000g 4℃离心5min后小心弃去乙醇（为了更好的控制RNA中的盐离子量，应尽量除尽乙醇）。 RNA的溶解 室温干燥沉淀2~5min（不可以离心或者加热干燥，否则RNA很难溶解），加入适当的RNase-free水溶解沉淀，必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80℃保存。 TransScript First-Strand cDNA反转录试剂盒操作步骤 取1μg 总RNA，与100pmole（10pmole/μL）oligo dT(20)混匀，75℃变性10分钟，冰上退火，退火产物加DEPC水定容至20μL，全部加入Reverse transcript premix薄壁管中，42℃反应1小时，85℃灭活15秒。其产物为first-Strand cDNA，可直接作为模板用于定量反应。 Real-time PCR试剂盒操作步骤 QPCR Premix反应体系20μl，其成分为: SyBR Green Real-time PCR MasterM I X 10μl,混合溶液2μl,正反向引物共2.4μl,cDNA模板2μl，消毒去离子水3.6μl。反应条件:95℃ 预变性 30 s；95℃变性 5 s、60℃退火15s、72℃延伸45s，40个循环； -20℃ 保存。 |
2楼2010-12-11 01:13:57
