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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】（引物设计）怎么防止pET28a中Nco1的ATG影响目的基因的表达？
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D调华丽

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】（引物设计）怎么防止pET28a中Nco1的ATG影响目的基因的表达？已有1人参与

我想在目的基因上游加NcoI酶切位点（C/CATGG），把目的基因连到pET28a上。
因为目的基因自身也有ATG，而用NcoI酶切后与pET28a连接上后NcoI也会剩一个ATG，所以目的基因前面也有个ATG了， 翻译应该是从NcoI酶切剩下的ATG开始的吧，
如果在目的基因上ATG翻译之前，先终止一次的话，后面的目的基因还可以继续翻译吗？
或者还有其他方法 让pET28a中Nco1酶切后剩的ATG不影响目的基因的表达？
请相关人才指点一下哈！
谢谢！

[ Last edited by D调华丽 on 2010-10-31 at 14:06 ]
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人生一场就是在不同的时候竖起不同的手指~
1楼2010-10-30 22:33:58
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D调华丽

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by xuweitao at 2010-10-31 08:03:34:
没听明白你问的问题。
NcoI(CCATGG)里的atg是紧跟在pET28a里的T7 promoter 之后，其后的DNA序列将被转录并试图在核糖体上翻译为蛋白。你的目的基因一般也是以atg开始的，如果直接按照其后密码子的序列加上去的话 ...

或者表达后目的蛋白前面连有几个杂氨基酸会影响目的蛋白的活性吗？
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人生一场就是在不同的时候竖起不同的手指~
6楼2010-10-31 12:13:44
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elvias

铁杆木虫 (正式写手)
D调华丽(金币+1): 2011-04-27 12:51:04
pET28a上好像有NcoI酶切位点，我就不太明白你说的意思了
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2楼2010-10-30 23:49:11
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xuweitao

铁杆木虫 (著名写手)
D调华丽(金币+1):先谢了 2010-10-31 12:12:51
D调华丽(金币+1): 2011-04-27 12:50:18
D调华丽(金币+1): 2011-04-27 12:51:18
没听明白你问的问题。
NcoI(CCATGG)里的atg是紧跟在pET28a里的T7 promoter 之后，其后的DNA序列将被转录并试图在核糖体上翻译为蛋白。你的目的基因一般也是以atg开始的，如果直接按照其后密码子的序列加上去的话一般要在Met之后和你的蛋白直接多插入一个氨基酸。这一般对蛋白的表达和特性影响不大。

如果你的蛋白第二个氨基酸codon刚好可以是g开头（Val，Ala，Asp 或者 Glu）的话，恭喜你，你可以把第二个codon整合到NcoI里头，从而无差别的表达蛋白序列。

反正注意从NcoI里头的ATG开始，能够按帧翻译你的蛋白就行，N端的几个氨基酸差别应该不至于影响你的基因表达。
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3楼2010-10-31 08:03:34
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D调华丽

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by elvias at 2010-10-30 23:49:11:
pET28a上好像有NcoI酶切位点，我就不太明白你说的意思了

是呀，我就是想把目的基因连到pET28a上面去
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人生一场就是在不同的时候竖起不同的手指~
4楼2010-10-31 11:53:23
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