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D调华丽

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】（引物设计）怎么防止pET28a中Nco1的ATG影响目的基因的表达？ 已有1人参与

我想在目的基因上游加NcoI酶切位点（C/CATGG），把目的基因连到pET28a上。
因为目的基因自身也有ATG，而用NcoI酶切后与pET28a连接上后NcoI也会剩一个ATG，所以目的基因前面也有个ATG了， 翻译应该是从NcoI酶切剩下的ATG开始的吧，
如果在目的基因上ATG翻译之前，先终止一次的话，后面的目的基因还可以继续翻译吗？
或者还有其他方法 让pET28a中Nco1酶切后剩的ATG不影响目的基因的表达？
请相关人才指点一下哈！
谢谢！

[ Last edited by D调华丽 on 2010-10-31 at 14:06 ]
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人生一场就是在不同的时候竖起不同的手指~
1楼 2010-10-30 22:33:58
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D调华丽

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by xuweitao at 2010-10-31 08:03:34:
没听明白你问的问题。
NcoI(CCATGG)里的atg是紧跟在pET28a里的T7 promoter 之后，其后的DNA序列将被转录并试图在核糖体上翻译为蛋白。你的目的基因一般也是以atg开始的，如果直接按照其后密码子的序列加上去的话 ...

我想在目的基因上游加NcoI酶切位点（C/CATGG），把目的基因连到pET28a上。
因为目的基因自身也有ATG，而用NcoI酶切后与pET28a连接上后NcoI也会剩一个ATG，所以目的基因前面也有个ATG了， 翻译应该是从NcoI酶切剩下的ATG开始的吧，
目的蛋白前面连了几个杂蛋白会影响目的蛋白的活性的吧？

如果在目的基因上ATG翻译之前，先终止一次的话，后面的目的基因还可以继续翻译吗？
或者还有其他方法 让pET28a中Nco1酶切后剩的ATG不影响目的基因的表达？
谢谢！
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人生一场就是在不同的时候竖起不同的手指~
5楼2010-10-31 12:06:21
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elvias

铁杆木虫 (正式写手)
D调华丽(金币+1): 2011-04-27 12:51:04
pET28a上好像有NcoI酶切位点，我就不太明白你说的意思了
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2楼2010-10-30 23:49:11
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xuweitao

铁杆木虫 (著名写手)
D调华丽(金币+1):先谢了 2010-10-31 12:12:51
D调华丽(金币+1): 2011-04-27 12:50:18
D调华丽(金币+1): 2011-04-27 12:51:18
没听明白你问的问题。
NcoI(CCATGG)里的atg是紧跟在pET28a里的T7 promoter 之后，其后的DNA序列将被转录并试图在核糖体上翻译为蛋白。你的目的基因一般也是以atg开始的，如果直接按照其后密码子的序列加上去的话一般要在Met之后和你的蛋白直接多插入一个氨基酸。这一般对蛋白的表达和特性影响不大。

如果你的蛋白第二个氨基酸codon刚好可以是g开头（Val，Ala，Asp 或者 Glu）的话，恭喜你，你可以把第二个codon整合到NcoI里头，从而无差别的表达蛋白序列。

反正注意从NcoI里头的ATG开始，能够按帧翻译你的蛋白就行，N端的几个氨基酸差别应该不至于影响你的基因表达。
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3楼2010-10-31 08:03:34
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D调华丽

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by elvias at 2010-10-30 23:49:11:
pET28a上好像有NcoI酶切位点，我就不太明白你说的意思了

是呀，我就是想把目的基因连到pET28a上面去
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4楼2010-10-31 11:53:23
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