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dhmdddd

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】请教关于PCR

大家的PCR体系都用的是多少的啊？最近PCR 总是做不好，唉，很是郁闷的说，我的体系是这样子,我用的模板时煮的菌液,一般煮10-15分钟样子,50µL加4µL,25的加1µL,Buffer加5µL，DNTP加4µL，引物加0.5µL，剩下的水补齐，但是结果要不是没有结果，要不就是很暗，条件：我的目的片段是两千多，94℃ 1min，退火1min30s,延伸2min30s，
请各位指教，不胜感激！
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上班族，学习ing……
1楼 2010-10-28 09:00:08
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tongyanna

金虫 (正式写手)
dhmdddd(金币+1):谢谢，这个温度主要是考虑退火温度吧？我们都是用引物单子上面的温度减去7度…… 2010-10-28 14:37:51
要不然做个梯度PCR看看行不行！！！
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自己的路，自己快乐的走
2楼2010-10-28 09:07:49
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ben1147

木虫 (正式写手)
dhmdddd(金币+1): 2010-10-28 14:32:23
最重要的退火温度怎么不说呢。。。。。。。。

另外，体系各个成分重要的是终浓度，不是加入体积。你说引物加0.5uL，dNTP加4uL，贮液浓度是多少不说的话，还是不知道体系对不对
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3楼2010-10-28 09:44:16
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dhmdddd

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by ben1147 at 2010-10-28 09:44:16:
最重要的退火温度怎么不说呢。。。。。。。。

另外，体系各个成分重要的是终浓度，不是加入体积。你说引物加0.5uL，dNTP加4uL，贮液浓度是多少不说的话，还是不知道体系对不对

最终的退火温度是根据引物订单上的温度减去7度这样子，我的dNTP的浓度是各2.5mM,引物的浓度不是很清楚，单子找不到了这个是不是看Taq酶使用说明上体系的就可以吗？
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上班族，学习ing……
4楼2010-10-28 14:36:18
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