| 查看: 5368 | 回复: 13 | ||||
hopebiolqdhb金虫 (著名写手)
|
[交流]
【转帖】关于细菌超声破碎的一些经验总结 已有13人参与
|
|
细菌工程菌胞内表达主要分为两种形式，一种是在强启动子条件下的高效表达，由于蛋白的过度表达，使蛋白不能及时有效折叠而发生无规则卷曲，以固体颗粒的形式堆积于胞间质中，这就是所说的包涵体，另外一种是间质内的可溶性表达，即可以发生正常折叠，具有生物活性。一般情况下，细菌只要被正常破壁就可以通过离心的形式将包涵体和可溶性表达的蛋白分离开。 超声破碎的条件一般是300w，10s/10s，20分钟，具体条件可根据自身情况而定。 超声前菌体的准备：菌液离心后，先用PBS将菌沉淀洗2-3遍，然后按原菌液体积的1/5-1/10加入裂解液重悬菌体，裂解液的成分：50mMTris-HCl, pH8.0, 2mM EDTA，100mM NaCl，加溶菌酶至100ug/ml，0.1%Triton X-100。切记冰浴超声！ 如何判断是否超声完全：根据网友的经验，一般有以下几个方面： 1，外观判断：超声前菌悬液是浑浊的，超声完全后变的透明、清澈。 2，液体的粘滞性：超声后菌液从枪头滴下不粘连。 3，高速离心：有用高速离心检测超声破碎程度的（一般用6,000 g 10 min, 比一般离心收集菌体的转速高一点）。 沉淀是未破碎或破碎不完全的菌体。 4，染色：破碎后的菌液涂片，革兰氏结晶紫溶液染色0.5分钟，镜检。 超声后加入核酸酶消除核酸对蛋白的污染。 一些需要注意的问题： 1，蛋白以包涵体形式表达，追求的是高破碎率，要求细胞碎片很小，而另一种蛋白是可溶形式表达，所以细胞碎片不能很小，两种情况要求不同但目的相同，都是便于后期的固液分离。 2，如果超声时出现黑色沉淀，说明超声功率太强。 3，超声时间太长、功率太高对蛋白活性肯定有影响。 4，尽量防止泡沫的产生。 |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 超声破碎 |
» 猜你喜欢
今天务委会开完了，明天出结果吗
已经有8人回复
-
在坚冰还盖着北海的时候，我看到了怒放的梅花。
已经有7人回复
-
今日不放榜？网传国自然预计 8 月 27 日可查结果
已经有22人回复
-
某些机构，以效率低为荣，以效率低作为存在感
已经有9人回复
-
放榜前的不淡定
已经有18人回复
-
什么时候开奖？
已经有13人回复
-
如果此刻你正在为国基感到焦虑，不妨来听听这首《基金之外》
已经有8人回复
-
没有任何消息-是不是就凉了
已经有10人回复
-
人气不行了
已经有11人回复
-
2026国自然函评费到账
已经有22人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 胞内酶不能用超声破碎怎么办？
已经有15人回复
- 大肠杆菌超声破碎参数，求解！！！
已经有15人回复
- 如何用溶酶体破碎细菌细胞壁？？
已经有8人回复
- 求蓝藻（蓝细菌）的细胞壁破碎方法
已经有13人回复
- 求助革兰氏阳性菌的高效破碎方法
已经有12人回复
- 跪求，超声波破碎真菌细胞壁的条件，在线等。。。。
已经有20人回复
- 做双向的时候，关于超声破碎仪
已经有15人回复
- 【求助/交流】一个细菌破碎问题
已经有10人回复
- 【求助/交流】古细菌的细胞膜破碎（古细菌没有细胞壁）
已经有11人回复
- 【求助/交流】真菌细胞壁的破碎能不能用超声破碎法？
已经有14人回复
- 【求助/交流】关于超声破碎细菌~~~
已经有14人回复
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
| 谢谢分享！ |
2楼2010-10-18 14:54:28
happyever
金虫 (正式写手)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 1455.2
- 散金: 41
- 红花: 3
- 帖子: 505
- 在线: 193.1小时
- 虫号: 517967
- 注册: 2008-03-04
- 专业: 其他无机非金属材料
3楼2010-10-18 15:20:29
cheauyn
铁杆木虫 (正式写手)
- MicEPI: 1
- 应助: 11 (小学生)
- 金币: 16185.6
- 散金: 109
- 红花: 1
- 帖子: 659
- 在线: 223.7小时
- 虫号: 683944
- 注册: 2008-12-29
- 专业: 有机化工
4楼2010-10-18 16:14:52
 |
5楼2011-08-21 10:31:20
6楼2011-08-28 13:06:42
7楼2011-08-29 18:55:37
8楼2011-08-31 09:02:11
9楼2012-06-27 14:49:08
10楼2013-03-22 18:01:39
