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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】超大片段连接问题
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枚馨言子

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】超大片段连接问题 已有6人参与

我的是两个一万多bp的载体相连，将这两个载体用EcoRI单酶切，然后连接，转化后抗生素的板上，菌落是长满板的，然后做菌落PCR，一条带都没有（我的目的条带一个是3000多一个是5000多），不知道是没有连进去还是PCR片段太大没有扩出条带来。
    望高手能帮忙解答，不胜感激！！（附：其中还有一个问题就是 EcoRI单酶切是将环状质粒切成一条线性片段，多次酶切后每次跑胶都是酶切后比酶切前跑得快，也就是线性片段比环状质粒跑的快，不知道是酶切的问题，还是属于正常现象）
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如果你不是经常遇到挫折，这表明你做的事情没有很大的创新性！
1楼 2010-09-05 11:42:26
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srlee

铁杆木虫 (小有名气)
★ ★
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1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-09-05 12:47:59
看的不是太明白，建议酶切后低电压电泳回收条带，再行连接不知道会不会有所改善呢！
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2楼2010-09-05 12:20:46
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lzhwin

木虫 (正式写手)
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amisking(金币+2):鼓励交流！ 2010-09-05 19:43:41
单酶切又是大片段大载体肯定能够会有很高的自连率，为什么不用双酶切呢？
建议：双酶切或者加大片段的量并且用蓝白斑筛选
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3楼2010-09-05 14:46:00
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wangdianxi8

金虫 (小有名气)
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amisking(金币+2):鼓励交流！ 2010-09-05 19:43:51
是不是长的菌落，虽然是抗生素选择，但是是假阳性的，另外，你确定你提到DNA了吗？现在有仪器可以监测的，就是可以知道提取物的浓度和纯度，你可以多问一下做分子的同学，这个是很简单的
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4楼2010-09-05 14:52:21
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枚馨言子

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by lzhwin at 2010-09-05 14:46:00:
单酶切又是大片段大载体肯定能够会有很高的自连率，为什么不用双酶切呢？
建议：双酶切或者加大片段的量并且用蓝白斑筛选

我是将大的载体用EcoRI单酶切开之后，将另一个载体插入到里面，估计双酶切行不通，连接的时候我试了几种连接体系，还是不行呢
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5楼2010-09-05 15:42:39
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枚馨言子

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by wangdianxi8 at 2010-09-05 14:52:21:
是不是长的菌落，虽然是抗生素选择，但是是假阳性的，另外，你确定你提到DNA了吗？现在有仪器可以监测的，就是可以知道提取物的浓度和纯度，你可以多问一下做分子的同学，这个是很简单的

我是直接将已经提取出来的质粒用同一种酶单酶切之后，又将两个载体连接在一起的，应该这方面不会有问题，我知道大片段连接很难连，不知道谁做过大片段连接的，有好的办法不。我听别人说现在有些公司有一种专门连接大片段的载体和酶，不知道谁用这个方法连过，成功率高不高
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6楼2010-09-05 15:47:57
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lzhwin

木虫 (正式写手)
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scelab(金币+2):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-09-05 23:42:38
对啊，如果你两个载体都用单酶切然后连接，那么会产生三种情况：1、载体1自连 2、载体2自连 3、载体1 载体2相互连接。
第三种情况出现的概率很小
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7楼2010-09-05 16:33:27
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evan1987

铜虫 (小有名气)
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scelab(金币+5):鼓励新虫！欢迎多来交流！:tiger06: 2010-09-05 23:42:44
建议你载体单酶切后用SAP去磷酸化，这样载体就不会自连了。还有单酶切插入还有一个方向问题，没什么好的筛选方法，就多挑几个菌落做PCR了。
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8楼2010-09-05 21:59:45
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jasco

木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
silicare(金币+1):正解 2010-09-06 12:43:28
10k+10k，还是单酶切产物，这个难度相当大，
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9楼2010-09-06 09:40:20
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枚馨言子

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by jasco at 2010-09-06 09:40:20:
10k+10k，还是单酶切产物，这个难度相当大，

是呢，我再试试吧，谢谢大家了
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10楼2010-09-08 11:27:37
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