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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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枚馨言子

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】超大片段连接问题 已有6人参与

我的是两个一万多bp的载体相连,将这两个载体用EcoRI单酶切,然后连接,转化后抗生素的板上,菌落是长满板的,然后做菌落PCR,一条带都没有(我的目的条带一个是3000多一个是5000多),不知道是没有连进去还是PCR片段太大没有扩出条带来。
    望高手能帮忙解答,不胜感激!!(附:其中还有一个问题就是 EcoRI单酶切是将环状质粒切成一条线性片段,多次酶切后每次跑胶都是酶切后比酶切前跑得快,也就是线性片段比环状质粒跑的快,不知道是酶切的问题,还是属于正常现象)
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枚馨言子

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by jasco at 2010-09-06 09:40:20:
10k+10k,还是单酶切产物,这个难度相当大,

是呢,我再试试吧,谢谢大家了
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10楼2010-09-08 11:27:37
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srlee

铁杆木虫 (小有名气)

★ ★
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1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-09-05 12:47:59
看的不是太明白,建议酶切后低电压电泳回收条带,再行连接不知道会不会有所改善呢!
2楼2010-09-05 12:20:46
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lzhwin

木虫 (正式写手)

★ ★ ★
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amisking(金币+2):鼓励交流! 2010-09-05 19:43:41
单酶切又是大片段大载体肯定能够会有很高的自连率,为什么不用双酶切呢?
建议:双酶切或者加大片段的量并且用蓝白斑筛选
3楼2010-09-05 14:46:00
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wangdianxi8

金虫 (小有名气)

★ ★ ★
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amisking(金币+2):鼓励交流! 2010-09-05 19:43:51
是不是长的菌落,虽然是抗生素选择,但是是假阳性的,另外,你确定你提到DNA了吗?现在有仪器可以监测的,就是可以知道提取物的浓度和纯度,你可以多问一下做分子的同学,这个是很简单的
4楼2010-09-05 14:52:21
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