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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】超大片段连接问题
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枚馨言子

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】超大片段连接问题 已有6人参与

我的是两个一万多bp的载体相连，将这两个载体用EcoRI单酶切，然后连接，转化后抗生素的板上，菌落是长满板的，然后做菌落PCR，一条带都没有（我的目的条带一个是3000多一个是5000多），不知道是没有连进去还是PCR片段太大没有扩出条带来。
    望高手能帮忙解答，不胜感激！！（附：其中还有一个问题就是 EcoRI单酶切是将环状质粒切成一条线性片段，多次酶切后每次跑胶都是酶切后比酶切前跑得快，也就是线性片段比环状质粒跑的快，不知道是酶切的问题，还是属于正常现象）
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如果你不是经常遇到挫折，这表明你做的事情没有很大的创新性！
1楼 2010-09-05 11:42:26
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evan1987

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★
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scelab(金币+5):鼓励新虫！欢迎多来交流！:tiger06: 2010-09-05 23:42:44
建议你载体单酶切后用SAP去磷酸化，这样载体就不会自连了。还有单酶切插入还有一个方向问题，没什么好的筛选方法，就多挑几个菌落做PCR了。
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8楼2010-09-05 21:59:45
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srlee

铁杆木虫 (小有名气)
★ ★
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1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-09-05 12:47:59
看的不是太明白，建议酶切后低电压电泳回收条带，再行连接不知道会不会有所改善呢！
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2楼2010-09-05 12:20:46
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lzhwin

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
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amisking(金币+2):鼓励交流！ 2010-09-05 19:43:41
单酶切又是大片段大载体肯定能够会有很高的自连率，为什么不用双酶切呢？
建议：双酶切或者加大片段的量并且用蓝白斑筛选
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3楼2010-09-05 14:46:00
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wangdianxi8

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
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amisking(金币+2):鼓励交流！ 2010-09-05 19:43:51
是不是长的菌落，虽然是抗生素选择，但是是假阳性的，另外，你确定你提到DNA了吗？现在有仪器可以监测的，就是可以知道提取物的浓度和纯度，你可以多问一下做分子的同学，这个是很简单的
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4楼2010-09-05 14:52:21
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