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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】DNase I酶切实验
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lilirong2009

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】DNase I酶切实验

跑了个大肠杆菌和金黄色葡萄球菌基因组DNA，泳道3和4分别是大肠杆菌、金黄色葡萄球菌用DNase I 处理后的电泳图；泳道6和7是肠杆菌基因组DNA；泳道8和9是金黄色葡萄球菌基因组DNA；请问各位高手为什么基因组DNA酶切后电泳图是这样的，酶切不够？大肠杆菌的基因组DNA怎么会跑出这样的条带？
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1楼 2010-08-23 19:58:51
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zhixuec

木虫 (著名写手)
★ ★
amisking(金币+2):欢迎分享经验。 2010-08-23 21:00:03
lilirong2009(金币+1): 2010-08-23 21:54:51
那请问你用的是什么内切酶？

我做过很多DNA的酶切实验，从没有见过你这种图片的

从你的图片看，应该DNA没什么问题，可能是酶切时间、内切酶问题等，3号的DNA不纯，点样孔发亮，应该是蛋白，所以说纯度不够
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酷爱の族
2楼2010-08-23 20:10:21
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zhixuec

木虫 (著名写手)
通常酶切之后呈现smear状，不会像4号那样还是一条DNA谱带
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酷爱の族
3楼2010-08-23 20:11:49
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lilirong2009

铜虫 (小有名气)
我用的是DnaseI ，请问是一片无间断的亮带吗？
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4楼2010-08-23 21:54:22
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zhixuec

木虫 (著名写手)
lilirong2009(金币+1): 2010-08-27 19:34:50
DnaseI单酶切充分的话泳道呈现弥散带   

EB染色会呈现 就是你说的无间断亮带
EB替代燃料可能要加大胶的浓度，否则亮度会很弱

祝你实验顺利~！
引用回帖:
Originally posted by lilirong2009 at 2010-08-23 21:54:22:
我用的是DnaseI ，请问是一片无间断的亮带吗？

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酷爱の族
5楼2010-08-24 13:01:44
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lilirong2009

铜虫 (小有名气)
我们现在就是用EB染色的，亮带很弱看起来像拖尾一样。我加了一种能与DNA相互作用的蛋白之后，基因组DNA就没有被DNaseI 切割，楼上大哥有没有做过DNaseI足迹实验，是不是要求DNA片段大小在300bp之间做足迹实验才比较适合？
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6楼2010-08-24 14:21:09
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微笑漩涡

新虫 (著名写手)
lilirong2009(金币+1): 2010-08-27 19:35:03
楼上说的Smear在DNaseI完全酶切的情况下是不存在的，因为这个酶并不像我们平时

所用的RE，它不具有反响序列识别能力，完全随机切割DNA。所以，若是反应完全，

最后的结果会是10bp左右的条带。

PS：楼主的图跑的真的不敢恭维，一方面没有点marker（至少得用labda DNA、

HidIII），另一方面，不知道你的胶是不是0.8%的，跑的图太丑了。
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7楼2010-08-24 14:50:38
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wallace974

木虫 (小有名气)
lilirong2009(金币+1): 2010-08-27 19:34:58
1、lz太粗心了，做琼脂糖电泳都不加个Marker。
2、3,6,7泳道有蛋白或多糖污染，因而密度低，你加样的时候估计样品是飘起来了，有一部分并没有进入胶里，造成拖尾。
3、怀疑你的DNaseI有问题，4和8,9相比根本没有发生酶切，酶切后应该是弥散状，你换一个DNaseI试试，或者基因组浓度、酶切温度、酶切时间看看是不是和说明书上一致，特别是基因组浓度，从图片上看，你的基因组浓度很大。
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万物一理，万法自然
8楼2010-08-24 14:53:13
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lilirong2009

铜虫 (小有名气)
谢谢各位前辈的指正啊，不是粗心不加Marker啊，是剩的不多了不敢轻易用完，酶切后是施弥散状还是一个条带啊？谁有图片能否链接一下，谢谢啦！
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9楼2010-08-24 16:52:13
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