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南方科技大学公共卫生及应急管理学院2025级博士研究生招生报考通知
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lilirong2009

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】DNase I酶切实验

跑了个大肠杆菌和金黄色葡萄球菌基因组DNA,泳道3和4分别是大肠杆菌、金黄色葡萄球菌用DNase I 处理后的电泳图;泳道6和7是肠杆菌基因组DNA;泳道8和9是金黄色葡萄球菌基因组DNA;请问各位高手为什么基因组DNA酶切后电泳图是这样的,酶切不够?大肠杆菌的基因组DNA怎么会跑出这样的条带?

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zhixuec

木虫 (著名写手)

★ ★
amisking(金币+2):欢迎分享经验。 2010-08-23 21:00:03
lilirong2009(金币+1): 2010-08-23 21:54:51
那请问你用的是什么内切酶?

我做过很多DNA的酶切实验,从没有见过你这种图片的

从你的图片看,应该DNA没什么问题,可能是酶切时间、内切酶问题等,3号的DNA不纯,点样孔发亮,应该是蛋白,所以说纯度不够
酷爱の族
2楼2010-08-23 20:10:21
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zhixuec

木虫 (著名写手)

通常酶切之后呈现smear状,不会像4号那样还是一条DNA谱带
酷爱の族
3楼2010-08-23 20:11:49
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lilirong2009

铜虫 (小有名气)

我用的是DnaseI ,请问是一片无间断的亮带吗?
4楼2010-08-23 21:54:22
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zhixuec

木虫 (著名写手)

lilirong2009(金币+1): 2010-08-27 19:34:50
DnaseI单酶切充分的话泳道呈现弥散带   

EB染色会呈现 就是你说的无间断亮带
EB替代燃料可能要加大胶的浓度,否则亮度会很弱

祝你实验顺利~!
引用回帖:
Originally posted by lilirong2009 at 2010-08-23 21:54:22:
我用的是DnaseI ,请问是一片无间断的亮带吗?

酷爱の族
5楼2010-08-24 13:01:44
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lilirong2009

铜虫 (小有名气)

我们现在就是用EB染色的,亮带很弱看起来像拖尾一样。我加了一种能与DNA相互作用的蛋白之后,基因组DNA就没有被DNaseI 切割,楼上大哥有没有做过DNaseI足迹实验,是不是要求DNA片段大小在300bp之间做足迹实验才比较适合?
6楼2010-08-24 14:21:09
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微笑漩涡

新虫 (著名写手)

lilirong2009(金币+1): 2010-08-27 19:35:03
楼上说的Smear在DNaseI完全酶切的情况下是不存在的,因为这个酶并不像我们平时

所用的RE,它不具有反响序列识别能力,完全随机切割DNA。所以,若是反应完全,

最后的结果会是10bp左右的条带。

PS:楼主的图跑的真的不敢恭维,一方面没有点marker(至少得用labda DNA、

HidIII),另一方面,不知道你的胶是不是0.8%的,跑的图太丑了。
7楼2010-08-24 14:50:38
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wallace974

木虫 (小有名气)

lilirong2009(金币+1): 2010-08-27 19:34:58
1、lz太粗心了,做琼脂糖电泳都不加个Marker。
2、3,6,7泳道有蛋白或多糖污染,因而密度低,你加样的时候估计样品是飘起来了,有一部分并没有进入胶里,造成拖尾。
3、怀疑你的DNaseI有问题,4和8,9相比根本没有发生酶切,酶切后应该是弥散状,你换一个DNaseI试试,或者基因组浓度、酶切温度、酶切时间看看是不是和说明书上一致,特别是基因组浓度,从图片上看,你的基因组浓度很大。
万物一理,万法自然
8楼2010-08-24 14:53:13
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lilirong2009

铜虫 (小有名气)

谢谢各位前辈的指正啊,不是粗心不加Marker啊,是剩的不多了不敢轻易用完,酶切后是施弥散状还是一个条带啊?谁有图片能否链接一下,谢谢啦!
9楼2010-08-24 16:52:13
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