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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】western blot中的怪现象，求解~~~
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chinaluhy

银虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】western blot中的怪现象，求解~~~ 已有4人参与

事情是这样的，我是新手，学习做western blot有一个多月的时间。出现了一件怪事情，我们胶上的蛋白怎么也转不到膜上~~~实验室这么多年从来没有出现过的怪事~郁闷啊！
具体情况如下：
我们使用的是5%的浓缩胶，12的分离胶，湿法转膜。
15号上午我配了三块胶，16号上午另外一个同学配了一块胶，16号下午上样，16号晚上转膜过夜，恒流200mA，使用NC膜。17号上午拆掉转膜装置，丽春红预染时发现marker还在胶上，膜上几乎什么都没有。重新配置转膜液，17号晚上恒压30V转膜过夜，18号上午还是没有转上去。18号换了转膜液中的试剂，Tris，甘氨酸，甲醇，200mA转膜2小时，下午发现还是没有转上~~~我们又重新配制了两块胶，上样电泳后，将一块新胶和一块旧胶放在同一个转膜的盒子里，今天起来，新胶转上了，旧胶还是没转上~~~用考马斯亮蓝染旧胶，发现蛋白泳道都在胶上。
现在实验室的人都没有办法解释这个现象，希望有经验的人可以来指明方向。谢谢！
忘说了，实验还有师兄师姐在做，结果都很好。老师还让我们试了一下pvdf膜，还是转不上去。谢谢大家踊跃解答疑问~

[ Last edited by chinaluhy on 2010-8-19 at 18:31 ]
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如果你知道要往哪走，全世界都会为你让路。
1楼 2010-08-19 17:24:25
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)

合伙创业版兼职版主

优秀版主
amisking:管理不过来了，有意向做斑竹不。 2010-08-19 21:14:47
不排除你买到了假的NC膜，换个膜或pvdf试试
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2楼2010-08-19 17:34:49
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夜龙舞

金虫 (小有名气)
★ ★
amisking(金币+2):欢迎交流！ 2010-08-19 21:14:56
chinaluhy(金币+3):谢谢参与~ 2010-08-21 09:51:47
你的步骤没有错啊，只是我做的是按分子生物学实验操纵上定的电流，胶的面积cm*cm乘以0.6--0.8，结果是设定电流的值，电压随意调大，反正也达不到那么大的，一般是500伏特，没有短路是0瓦。一般都能转上，而且我不用丽春红颜色，嫌麻烦。没有遇到过你的这种情况。仅供参考。
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3楼2010-08-19 17:40:03
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
看天(金币+1):鼓励交流 2010-08-19 22:03:52
难道拿错膜拿成PVDF膜了？
你剪一小点膜出来泡一下甲醇看会不会瞬间变得透明许多
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4楼2010-08-19 17:54:26
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chinaluhy

银虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by silicare at 2010-08-19 17:34:49:
不排除你买到了假的NC膜，换个膜或pvdf试试

没，我们师兄师姐用相同的膜节好好的！
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5楼2010-08-19 18:33:04
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chinaluhy

银虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 夜龙舞 at 2010-08-19 17:40:03:
你的步骤没有错啊，只是我做的是按分子生物学实验操纵上定的电流，胶的面积cm*cm乘以0.6--0.8，结果是设定电流的值，电压随意调大，反正也达不到那么大的，一般是500伏特，没有短路是0瓦。一般都能转上，而且我不 ...

我们实验室正常2h转膜是恒流200mA，此时电压在80V左右。
转膜过夜的时候是恒流60mA或者恒压30v。
谢谢参与~
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6楼2010-08-19 18:34:37
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chinaluhy

银虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-08-19 17:54:26:
难道拿错膜拿成PVDF膜了？
你剪一小点膜出来泡一下甲醇看会不会瞬间变得透明许多

确定是NC膜，两个膜都试了，转不上~
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7楼2010-08-19 18:35:10
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zhandeguo1

银虫 (小有名气)

western blotting

胶配的可能就有问题啊。考虑是否弄错试剂了。
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8楼2010-08-19 21:40:18
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dhd997

荣誉版主 (文坛精英)

自由人，我型我秀！

优秀版主
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-08-19 17:54:26:
难道拿错膜拿成PVDF膜了？
你剪一小点膜出来泡一下甲醇看会不会瞬间变得透明许多

会不会正负极搞错了？
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人生不过几十年，成败荣辱都在天，是非恩怨莫在意，健康快乐最值钱，自古人间苦无边，看得高远境如仙，愿你不为凡事恼，轻松快乐每一天。
9楼2010-08-19 22:15:49
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云泽紫樱

银虫 (小有名气)
NC膜要不要活化？没用过NC膜，pvdf是要先泡甲醇的，NC膜有类似的要求没？
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“幸福”就是猫吃鱼，狗吃肉，奥特曼打小怪兽~
10楼2010-08-19 22:27:21
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