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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】从蛋白胶里回收蛋白
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芝之

木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】从蛋白胶里回收蛋白 已有7人参与

如题，该如何操作呢，请有经验的战友们介绍下
3Q~
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1楼 2010-08-17 11:25:41
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段家一凡

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2010-08-18 06:17:12
引用回帖:
Originally posted by sqhnsd at 2010-08-17 16:46:46:

跑不动。SDS-PAGE之所以能跑，就是因为SDS-Protein complex带负电荷。你查一些native gel的方法，可以不用加SDS，但是需要加一些别的东西是蛋白带上电荷才能在胶里面运动。

蛋白在native-page中是可以跑得动的，它的原理是根据蛋白的大小和电荷的多少来决定电泳速度的，不用再添加什么东西，只要把SDS去掉就可以了。但如果是碱性蛋白就不行了，这时要把电泳液换成酸性buffer。
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12楼2010-08-17 20:29:07
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段家一凡

木虫 (正式写手)
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2010-08-18 06:17:21
引用回帖:
Originally posted by sqhnsd at 2010-08-17 20:34:46:

我们非变性的电泳就做过blue native gel，那个也是一种燃料，使蛋白带电然后分离。你说的那种什么都不加的胶跑的效果怎么样？

蛋白本来就带有电荷，如天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸等都带有电荷， 你添加SDS只是使所有蛋白质都带上了负电，屏蔽了自身所带的电荷，所以电泳的远近只和蛋白质的分子量有关系了。非变性胶就是利用蛋白本身所带的电荷进行电泳的，跑出来的效果没有SDS-PAGE的好，有时可能有一点拖带，但这是很常用的一种方法。比如双向电泳的第一项就是等点聚焦，利用的就是不同蛋白质的所带电荷来分离的。我们跑的native-page也加染料，就是把SDS去掉的染料就可以了。除非你有什么特殊的目的，确实什么都不用添加的。
关于蛋白的回收用该方法也可以，你可以只染一个泳道的就行了，其他的你就按照染色的泳道对回来就可以了，切下胶条后如楼上所述，把胶条尽量切碎，加入缓冲液，4度过夜，然后离心取上清，浓缩可以用超滤管（10kD或30Kd的截留量）就可以了，回收率可能不高。
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14楼2010-08-18 00:45:42
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