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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】从蛋白胶里回收蛋白
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芝之

木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】从蛋白胶里回收蛋白 已有7人参与

如题，该如何操作呢，请有经验的战友们介绍下
3Q~
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1楼 2010-08-17 11:25:41
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cpn

木虫 (正式写手)
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scelab(金币+2):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-08-17 16:26:33
偶自己没做，不过看偶的师弟折腾了好几个月，看lz后面的目的是要干什么了咯~~
是SDS-PAGE中回收的话，SDS的除去很重要，如果是要MS分析的话。
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2楼2010-08-17 14:53:30
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芝之

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by cpn at 2010-08-17 14:53:30:
偶自己没做，不过看偶的师弟折腾了好几个月，看lz后面的目的是要干什么了咯~~
是SDS-PAGE中回收的话，SDS的除去很重要，如果是要MS分析的话。

我想做非变性电泳，然后条带回收，具体是怎么操作的呢，是透析袋什么的么？
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3楼2010-08-17 15:44:55
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sqhnsd

金虫 (正式写手)
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scelab(金币+3):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-08-17 16:26:43
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Originally posted by 芝之 at 2010-08-17 15:44:55:


我想做非变性电泳，然后条带回收，具体是怎么操作的呢，是透析袋什么的么？

如果非变性的话，就不能用电洗脱了，因为你不能加电泳液进去，也就是不能接触SDS。你可以考虑扩散的方法将蛋白从胶中提出来（切碎胶，加入10倍胶体积的buffer,震荡过夜，回收率可能只有30%左右，这个胶不能染，染了之后蛋白沉淀在胶里面，很难出来）
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4楼2010-08-17 15:52:55
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芝之

木虫 (小有名气)
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Originally posted by sqhnsd at 2010-08-17 15:52:55:

如果非变性的话，就不能用电洗脱了，因为你不能加电泳液进去，也就是不能接触SDS。你可以考虑扩散的方法将蛋白从胶中提出来（切碎胶，加入10倍胶体积的buffer,震荡过夜，回收率可能只有30%左右，这个胶不能染， ...

非常感谢，我还是想问，如果我用电泳液不加SDS会怎么样
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5楼2010-08-17 16:36:17
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sqhnsd

金虫 (正式写手)
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Originally posted by 芝之 at 2010-08-17 16:36:17:


非常感谢，我还是想问，如果我用电泳液不加SDS会怎么样

跑不动。SDS-PAGE之所以能跑，就是因为SDS-Protein complex带负电荷。你查一些native gel的方法，可以不用加SDS，但是需要加一些别的东西是蛋白带上电荷才能在胶里面运动。
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6楼2010-08-17 16:46:46
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芝之

木虫 (小有名气)
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Originally posted by sqhnsd at 2010-08-17 16:46:46:

跑不动。SDS-PAGE之所以能跑，就是因为SDS-Protein complex带负电荷。你查一些native gel的方法，可以不用加SDS，但是需要加一些别的东西是蛋白带上电荷才能在胶里面运动。

原来原理是这个，那那个用扩散的方法的，就是弄碎一些，然后震荡过夜，第二天离心去沉淀就可以了吧
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7楼2010-08-17 16:50:09
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sqhnsd

金虫 (正式写手)
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Originally posted by 芝之 at 2010-08-17 16:50:09:

原来原理是这个，那那个用扩散的方法的，就是弄碎一些，然后震荡过夜，第二天离心去沉淀就可以了吧

能冻干吗？沉淀之后你还要损失好多呢？至少40%的蛋白要损失掉，越稀损失越多
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8楼2010-08-17 17:42:43
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芝之

木虫 (小有名气)
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Originally posted by sqhnsd at 2010-08-17 17:42:43:

能冻干吗？沉淀之后你还要损失好多呢？至少40%的蛋白要损失掉，越稀损失越多

实验室可以冻干，可是直接冻干的话，会参杂着胶的东西么？
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9楼2010-08-17 18:02:11
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sqhnsd

金虫 (正式写手)
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Originally posted by 芝之 at 2010-08-17 18:02:11:

实验室可以冻干，可是直接冻干的话，会参杂着胶的东西么？

先离心，去除胶，然后搜集上清冻干
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10楼2010-08-17 18:28:20
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