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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】连T载体后，转化不成功！请各位同仁帮忙分析下！有图有数据
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ltakashi

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】连T载体后，转化不成功！请各位同仁帮忙分析下！有图有数据 已有15人参与

我的目的片段1800左右，连了5次T，转化后，板上没有菌落！
昨天和一个师姐又做了一次转化，今早还是没长，但是她的板长啦！

我的目的回收条带，如图！我只切了很亮的部分，下面拖尾的部分没切！

回收后，测了DNA含量！
A260/A280=1.91,
含量31.7ng/微升
用的是TAKARA公司的PMD18-T试剂盒

我用了三个连接体系是：
一个是：solution I:  5微升，片段：4微升 ，T载体：1 微升
算出来的T载体摩尔数与插入片段载体摩尔数约是：1：3
一个是：solution I:  5微升，片段：5微升 ，T载体：1 微升
算出来的T载体摩尔数与插入片段载体摩尔数约是：1：4
一个是：solution I:  5微升，片段：5微升 ，T载体：1 微升
算出来的T载体摩尔数与插入片段载体摩尔数约是：1：5

连接时间是：16个小时左右
另外感受态是当天做的！
不存在问题！

请各位帮我分析下，哪里出了问题！

[ Last edited by ltakashi on 2010-7-24 at 09:37 ]
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1楼 2010-07-24 09:33:53
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ltakashi

银虫 (小有名气)
在线等！！
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2楼2010-07-24 09:34:20
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ltakashi

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yinsongna at 2010-07-24 10:15:41:
你的抗生素没加错吧

我的平板是LB加AMP！
我们实验室都是这么弄的！
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5楼2010-07-24 10:28:45
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ltakashi

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yinsongna at 2010-07-24 10:17:10:
你做的TA克隆，你的目的条带是PCR产物？用什么酶P的，PFU的话，末端没有A的

我们实验室用的酶都是TAQ MIX！自动在PCR产物末端加A！
赞一下 回复此楼
6楼2010-07-24 10:29:19
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ltakashi

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by ltakashi at 2010-07-24 10:29:19:

是PCR产物！
我们实验室用的酶都是TAQ MIX！自动在PCR产物末端加A！

7楼2010-07-24 10:30:08
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ltakashi

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yinsongna at 2010-07-24 10:34:04:
你是不是转化过程出错了

没有！
是师姐帮我做的！
但是她的板长了，我的没长！
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10楼2010-07-24 10:50:54
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ltakashi

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yinsongna at 2010-07-24 10:40:46:
再不成换个T载体

不行噢！
T载体是刚买的！
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11楼2010-07-24 10:51:32
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ltakashi

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zhaohq1209 at 2010-07-24 10:57:06:
你师姐的片段多长？

我的片段1800左右~
她的片段比我小一点吧~~
但是，这个也不存在问题啊
有人更大的片段都连上去了~~
我的1800也不是很大呀！
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14楼2010-07-24 11:00:13
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ltakashi

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by darwinxie at 2010-07-24 10:56:08:
这么说来好奇怪哦，没遇见转化失败的经验

我也很无语！
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15楼2010-07-24 11:00:30
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ltakashi

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zhaohq1209 at 2010-07-24 11:19:58:

我最近也做T克隆，用的是TAKARA的PMD-20，据说蓝白斑筛选效果较好。
>6k的片段也能做出来，但有几个4k~5k的片段也出了lz说的情况，做了三次也没做出来，涂板长菌，蓝白都有，但白菌都是假阳性。
建议lz想想 ...

谢谢你的回贴
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17楼2010-07-24 12:34:57
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