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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】酿酒酵母表达载体的构建问题
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xtcao668

至尊木虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】酿酒酵母表达载体的构建问题 已有4人参与

我在构建酿酒酵母表达载体时遇到一个问题，请各位帮忙。 由于用的酵母受体菌为工业菌株，缺乏必要的筛选标记，想在表达载体上加入KAN基因抗性，用G418去筛选转化子。
    问题是如果把KAN基因表达载体启动子后面，接下来再是要表达的基因片段，请问各位这样是不是基因片段不能表达啊？ 盼高人指导！
     谢谢！
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生活的理想就是理想的生活
1楼 2010-07-16 11:11:23
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lwiaanngg

铁杆木虫 (著名写手)
★
看天(金币+1):谢谢回答 2010-07-16 12:23:14
xtcao668(金币+1): 2010-07-16 15:04:32
你不要把这两个基因放在一个启动子下。一般质粒，Kan不会放在和要表达基因片段一起的。你的KAN基因表达需要另一个启动子的
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2楼2010-07-16 11:57:17
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
xtcao668(金币+1): 2010-07-16 15:04:36
请问你的表达载体是附加型的还是整合型的？
酿酒酵母表达载体启动子没有那么强的作用，对于附加型质粒，同时插入多个基因，都需要有各自的启动子和终止子，组成完整的表达元件。对于整合型，每次也只是整合一个基因后，删除筛选标记，再整合第二个基因，或者换其他筛选标记的载体。
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Thank-you，so-blue.
3楼2010-07-16 14:57:45
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
xtcao668(金币+1): 2010-07-16 15:04:08
不知道你的工作是做工程酵母还是构建载体，如果做工程酵母，建议前期还是用实验室菌株，筛选标记很多。另外也有工业菌株带筛选标记的，BY4741，BY4742
如果是要构建载体，建议获得抗性基因时构建完整的抗性基因表达元件，插入到载体启动子前面，而不是启动子后面。（载体pUG6上有完整的TEF1p-kanMX-TEF1t元件，用于敲除，你可以扩增下来当筛选标记）
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Thank-you，so-blue.
4楼2010-07-16 15:02:40
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wurenzhi0721

铁虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
楼主做得怎么样了？做成功了吗？谢谢
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你快乐所以我快乐，我快乐所以大家也快乐
5楼2012-08-14 22:37:09
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wurenzhi0721

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
525785楼: Originally posted by susizheng at 2010-07-16 14:57:45
请问你的表达载体是附加型的还是整合型的？
酿酒酵母表达载体启动子没有那么强的作用，对于附加型质粒，同时插入多个基因，都需要有各自的启动子和终止子，组成完整的表达元件。对于整合型，每次也只是整合一个基因 ...

希望您继续指点啊，能否说得详细点
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你快乐所以我快乐，我快乐所以大家也快乐
6楼2012-08-14 22:38:45
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woshizhufeng

新虫 (小有名气)
我只知道每个基因需要各自的启动子，祝楼主成功。
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7楼2012-08-15 08:56:54
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