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vivihao金虫 (小有名气)
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[交流]
【求助/交流】荧光双分子互补技术 已有2人参与
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有没有哪个哥哥姐姐做过荧光双分子互补实验研究蛋白间的相互作用？小弟我现如今要做，不知道如何下手，首先构建载体方面的问题，如果我用GFP，譬如说N端部分GFP是到第几个氨基酸为止，C端部分GFP呢？ 看到有文献说N端GFP的第155或173个氨基酸位置后连着A蛋白核苷酸序列，余下的GFP蛋白的核苷酸序列连接B蛋白核苷酸序列。构建好了2个载体同时转染细胞，看有没有荧光。 请问大侠是不是这样弄的？帮小弟解惑吧 |
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5楼2015-04-28 20:43:55
mgangle
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2楼2010-07-09 14:29:58
mgangle
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vivihao(金币+3):首先谢谢您回帖，我觉得您理解的可能有些偏差，好像是一个载体是P-nGFP-A,另一个载体是P-cGFP-B,然后共转染细胞，如果出现荧光说明AB蛋白互作。我现在想知道是在GFP的那个位置断开融合AB蛋白序列？既然您实验室的人有做过的，还请帮我您了解下，不盛感激！ 2010-07-09 16:24:10
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其实我也没有做过，只是实验室其他人干过，我是这样理解的 如果你要验证A，B蛋白是否互作，那么你要构建： nGFP+A，nGFP+B，cGFP+B，cGFP+A 然后去A，B载体两两组合。这样我们连接的A，B蛋白都可以位于nGFP，cGFP的C端，不用再去考虑A，B蛋白是否会由于位置不同而导致不互作！ 我是这么理解的仅供参考！呵呵！ |
3楼2010-07-09 15:34:22
mgangle
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看天(金币+3):如此的热心 2010-07-09 18:16:06
vivihao(金币+5):真的谢谢您了，那么热心让小弟很感动。这2篇文献我都看了，上面说到在构建载体的时候在N端GFP后还有加上一段几个氨基酸组成的linker,而有的文献上面没有介绍啊？不知道到底要不要加？我是做昆虫的，载体只能自己构建，买了不了啊，悲剧 2010-07-12 10:23:59
看天(金币+3):如此的热心 2010-07-09 18:16:06
vivihao(金币+5):真的谢谢您了，那么热心让小弟很感动。这2篇文献我都看了，上面说到在构建载体的时候在N端GFP后还有加上一段几个氨基酸组成的linker,而有的文献上面没有介绍啊？不知道到底要不要加？我是做昆虫的，载体只能自己构建，买了不了啊，悲剧 2010-07-12 10:23:59
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你好！我帮你问了一下！他们的BiFC载体是从公司购买的，所以没有自己去构建，他们用的是YFP从155个氨基酸处插入，我也查了一部分文章，文章中指出 Geoffrey 等[4]研究发现，在GFP 的两个β片层之间的环结构上至少有10 个位点可以插入外源蛋白而不影响GFP 的荧光活性，但激发波长和发射波长会略有改变. 例在GFP 的第144 个和145 个氨基酸之间插入外源蛋白序列，用487 nm 波长的光波激发后，仍能产生波长为512 nm 的荧光. 附上文献，希望对你有用！ http://www.brsbox.com/filebox/do ... bb709669d685b9821b5 http://www.brsbox.com/filebox/do ... ecc8279a5e96268b0e0 |
4楼2010-07-09 17:27:20
