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【讨论】直接滴定法测多糖 已有10人参与
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有人用直接滴定法测多糖含量么？ 是不是测之前要先吧多糖完全水解，但是查了好多文献，都说只是部分水解，有没有能完全水解多糖的方法？ 不知道不完全水解的话，能不能直接测多糖含量？ 希望各位同学能够帮忙 |
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禹森319
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多糖含量测定 关于多糖含量测定，业内有两种评价方法。一种是狭义上严格的多糖测定，即水提取多糖后，以凝胶色谱柱分离、洗脱提纯粗多糖得到较单一分子量的多糖，再水解成各种单糖，以HPLC法分离测定各单糖，即可得到比较严格意义上的多糖含量及其组成。这种方法是科研级的多糖测定。 另一种评价方法一般是生产企业用于质控的多糖测定：一般过程是水提醇沉粗多糖后，以葡萄糖作为相比较的物质，加入特定显色剂后比色测定粗多糖的含量。注意，这种方法测得的是以葡萄糖作为折算的多糖含量。但这种评价方法简单实用，能反映一定的质量指标，作为质控之用可以的了。包括中国药典和一些国标、行标都采用此方法评价多糖含量，方法大同小异，如硫酸-苯酚法，硫酸-蒽酮法。但根据不少实际检验人的反映，要想检测结果有很好的重现性，还是有很多细节问题要注意的。 以下是本人亲自做过的方法过程，觉得重现性和准确性都不错的。因为不同的检验室检验工具不太一样，大家可以实事求是作变通。但要充分认识本检验方法的原理，过程要避免干扰哦。可以找本《中药化学》看看。 中药总多糖含量测定（苯酚-硫酸比色法） 供试品溶液的制备：①提取上清液：精密称取样品细粉2.2g（约相当于多糖0.22g），置烧瓶中，加水100ml置电炉上加热回流提取1.5h，放冷至室温，3000～4000rpm离心10min，收集上清液，用少量水分次洗涤烧瓶及离心管，同样离心收集上清液。 ②提取多糖沉淀：合并全部上清液置蒸发皿中，置电炉上小心加热（避免焦化）浓缩到约15ml，放冷至室温，加乙醇100ml，搅匀，放置使其沉淀15分钟。转移此溶液连同沉淀于离心管中，继续用少量80%乙醇以玻棒充分刮洗蒸发皿，洗液和沉淀同样转移至离心管中，以3000～4000rpm速度离心15min，弃去上清液，在离心管中加入少量80%乙醇，轻轻洗涤，同样离心弃去上清液（保留沉淀物）。 然后将离心管（连同沉淀物）于50℃烘箱挥干乙醇（不能见到任何液体），然后加热水溶解沉淀，转移至250ml量瓶中，继续用热水以玻棒充分刮洗离心管，洗液同样转移至250ml量瓶中，放冷至室温，用水定容至刻度，摇匀，精密量取5ml置100ml量瓶中，用水定容至刻度，摇匀即得供试品溶液。 标准曲线的制作：精密称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖适量，加水配制成0.85mg/ml的贮备液。精密吸取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ml分别置于50ml量瓶中加水定容至刻度，摇匀得葡萄糖稀释液。再分别精密量取上述各稀释液2 ml置具塞试管中，同时精密量取水2.0 ml置另一具塞试管中，各管分别加5%苯酚溶液（新制）1 ml，摇匀，然后迅速加入浓硫酸5.0ml，立即摇匀，于40℃水浴中保温30min，取出，置冰水浴中5 min。以上述2.0ml水所制得的空白溶液做参比，于489nm波长处测定各溶液吸收度，以葡萄糖稀释液的浓度（μg/ml）为横坐标，吸收度为纵坐标，绘制标准曲线。备注：在准确度要求不很高时，可用对照品一点法代替标准曲线，即对照品只做一个点（精密取5.0ml葡萄糖贮备液稀释至100ml得葡萄糖稀释液，然后进行苯酚-硫酸反应，测定吸收度）。 样品测定：取供试品溶液2.0ml置具塞试管中，按“标准曲线的制作”项下同法加苯酚溶液和浓硫酸，测定吸收度。根据样品吸收度从标准曲线上读取葡萄糖浓度，再计算出样品中总多糖的含量（以葡萄糖计）。备注：如果采用对照品一点法，则根据吸收度比值计算样品中总多糖的含量。 |
15楼2010-09-07 09:01:54
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粗多糖测定 多糖的测定方法，目前有碱性酒石酸铜滴定法、比色法（蒽酮比色法、硫酸-苯酚法）。一般说来，比色法的优点是灵敏度高，达到µg/ml（滴定法一般为mg/ml），样品用量少；但缺点是一般做常规检测时使用葡萄糖作标准品，误差较大，应以被测物的纯品作对照品，以求出换算因子，但要制备被测物的纯品并非每个实验室所能做到的，而且保健食品中往往是多种中草药的提取物作为原料而制成，所含多糖是不同相对分子量多糖的混合体，这就给提取纯品增加了难度。所以当成品中多糖含量大于1%（质量浓度）时，最好选用碱性酒石酸铜滴定。 滴定法 1.样品预处理 取本品适量，精密称定，置于250ml磨口烧瓶中，精密加水50ml，称定重量，置沸水浴回流2小时，放置至室温，用水补足减失重量，混匀，滤过，精密吸取续滤液15ml于100ml离心管中，加无水乙醇75ml，混匀，以4000r/min离心10min，并小心弃去上清液,再加15ml热水(温度＞90℃)冲洗离心管中沉淀物,重复一次后再以4000r/min离心30min，弃去上清液，沉淀用乙醇液（水：乙醇=15：75）洗涤两次，离心，弃去洗涤液。 2.样品水解 将离心管中醇析物用50ml热水（温度＞90℃)少量多次转移至250ml磨口三角瓶中，加入15ml浓盐酸，开启冷凝管，在沸水浴中回流2h，冷却，先用40％的氢氧化钠（约15ml）粗调Ph值，后用稀的氢氧化钠溶液细调，再置于PH计上调整pH在6.8～7.2之间。将中和的酸解液移置至100ml容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀,过滤，滤液供滴定用。 3.碱性酒石酸钾钠铜溶液标定 3.1精密吸取碱性酒石酸铜甲、乙液各5ml于150ml的锥形瓶中，加10ml蒸馏水及2粒玻璃珠，用滴定管加入9.0ml葡萄糖标准溶液于锥形瓶中。 3.2将锥形瓶置电炉上迅速加热，务必在2分钟内至沸，并保持溶液在微沸状态下再用标准葡萄糖溶液滴定，以每2秒1滴的速度滴定至蓝色刚好褪去为终点，记录消耗葡萄糖标准溶液的总体积。同法平行操作三份，取其平均值（V1）。 3.3样品溶液预测和测定。 3.3.1 样品溶液的预测 精密吸取碱性酒石酸铜甲、乙液各5ml于150ml的锥形瓶中，精密加入10ml蒸馏水及2粒玻璃珠，控制在2分钟内加热至沸，保持溶液在微沸状态下以先快后慢的速度，从滴定管中滴加样品水解液液进行滴定，直至溶液蓝色刚好褪去为终点，记录葡萄糖标准溶液消耗体积。 3.3.2样品溶液的测定 精密吸取碱性酒石酸铜甲液与乙液各5.0ml，置于150ml锥形瓶中，精密加入蒸馏水10ml及玻璃珠2粒，从滴定管滴加比预测体积少1ml的样品水解液，将锥形瓶置电炉上迅速加热，务必在2分钟内至沸，并保持溶液在微沸状态下再用样品水解液滴定，以每2秒1滴的速度滴定至蓝色刚好褪去为终点，记录消耗葡萄糖标准溶液的总体积。同法平行操作三份，得出平均消耗体积（V2）。 最后计算结果乘以0.9，此为葡萄糖换算成粗多糖的细数。 我比较过这三种方法：滴定法和硫酸-苯酚法重复性都还可以，关键是试验操作人员要充分理解试验步骤，注意细节。滴定法主要就是离心、洗涤、滴定。硫酸-苯酚法如果也是采用醇沉得到多糖，操作步骤也是注意离心、和洗涤除去单糖；如果是用碱性二价铜试剂选择性地从高分子中沉淀具有葡聚糖结构的多糖，用苯酚-硫酸法测定，需要注意的事项：在沉淀葡聚糖时尽量使被沉淀液里粗多糖的含量高些，然后在测定环节再稀释回适合浓度，这样可减少损失带来的误差，便于得到好的重复性；还有就是这一环节好多国标或文献给出的离心参数是3000转/分钟离心5分钟，试验过程中发现这个参数不合理，离心下来的沉淀在倾出上清液时会丢失，这也是好多试验人员说这个方法重复性不好的原因之一，参数应为4000转/分钟离心15分钟。蒽酮比色法不适合保健食品中多糖测定，应为这种方法需要测定液必须清澈透明，加热后不应该有沉淀；还有测定过程中所用蒽酮试剂中硫酸的浓度、取样液量、蒽酮试剂用量、沸水浴中反应时间，这几个操作条件的控制对试验结果影响很大，而且这几个条件之间是有联系的。不适合大生产检验。 以上资料均源自http://bbs.foodmate.net/viewthre ... p;extra=&page=2请参考 |
16楼2010-09-07 09:02:23
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