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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】做淀粉酶的请进 有奖
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zboter

银虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】做淀粉酶的请进 有奖 已有2人参与

我是刚做淀粉酶的，克隆表达了一段淀粉酶基因后，SDS-PAGE发现有目的蛋白表达，但是在测酶活的时候发现，当我把细胞破碎液加紧底物后，蛋白就会和淀粉共沉淀，请问这是怎么回事，如何解决?（胞内酶）
     酶活测定方法：取10 mL 1%的马铃薯淀粉溶液(pH 4.0)放入一支试管内，于40 ℃预热10 min后，加入1 mL的发酵酶液，摇匀，精确保温10 min。用移液管吸取1 mL反应液置于盛有10 mL、0.1 mol/L HCl的试管中，再取0.5 mL混合液体于盛有10 mL碘液的试管中，摇匀，并立即用分光光度计于660 nm处测定吸光度。用同样方法测定空白值，但不加发酵液，而带之以1.0 mL的蒸馏水。以蒸馏水作为参比液。
    酶活定义：1个酸性α-淀粉酶单位相当于在pH 4.0，温度40 ℃，1 min将浓度为1%的马铃薯淀粉溶液的显蓝强度降低1%时所需酶量。
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1楼 2010-07-01 16:31:21
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zboter

银虫 (正式写手)
我是克隆的外源基因，在大肠中表达的，所以说是胞内酶，你从哪看看出是生淀粉酶啊?老产生沉淀，这个酶活该怎么测呢？
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3楼2010-07-02 13:56:31
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
zboter(金币+1): 2010-07-02 13:53:25
生淀粉酶我没做过，不好意思，猜测是生淀粉酶吸附生淀粉，生淀粉是晶体结构，只有能吸附才能降解的。为什么要破碎细胞，淀粉酶几乎都是胞外酶的，为了方便纯化？
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
2楼2010-07-01 17:21:08
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★ ★
看天(金币+2):鼓励交流 2010-07-02 14:48:23
zboter(金币+1): 2010-07-03 20:37:11
会沉淀的淀粉难道是熟淀粉？把马铃薯淀粉粉碎过80目筛之后放到水里是绝对沉淀的。难道楼主将淀粉糊化后不液化就直接作为底物？为了方便收集酶液，克隆的时候去掉信号肽是很正常的，但有的淀粉酶基因有结合域，就要看楼主克隆的基因里有没有了。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
4楼2010-07-02 14:46:37
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zboter

银虫 (正式写手)
楼主可否发个qq仔细询问一下？我有好多不懂的。
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5楼2010-07-03 20:38:00
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